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DUSP5等胚胎干细胞自我更新相关基因的RNA干扰研究

作　者: 陈齐
导　师: 杨卫军；张铭
学　校: 浙江大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: 小鼠胚胎干细胞 慢病毒 RNA干扰 自我更新 DUSP5 AIRE
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell, ESC)是一种具有无限增殖能力,和分化成三个胚层全部细胞的多潜能性(pluripotent)干细胞,被广泛地应用于发育生物学和再生医学等研究中。研究ES细胞自我更新相关基因具有极其重要的意义,RNA干扰技术是该项研究的关键技术之一。由于胚胎干细胞的特殊性,大多数的转染试剂转染胚胎干细胞的效率都非常低,为建立高效的慢病毒介导的RNA干扰系统和揭示DUSP5等基因的表达规律及功能开展此项研究。本研究选择PEI作为转染试剂,将病毒质粒(pLKO.1系列质粒)、包装质粒(psPAX2)和外衣质粒(pMD2.G)共转染到HEK293T细胞内,制备出具有高侵染能力的慢病毒载体。优化条件为PEI和质粒的质量比为12：1,PEI浓度不超过25μg/ml,转染处理时间为10-12h,制备慢病毒载体的效率最高。慢病毒包装颗粒12h收集一次,共收集4-6次。在原本病毒质粒pLKO.1的基础上,用EGFP基因替代嘌呤酶素抗性基因,构建了相应的以EGFP作为报告基因的shRNA病毒质粒,可以直接观察和筛选阳性克隆,加快了筛选周期。制备的病毒,能够高效感染永生化细胞系如HEK293/293T、K562、A02、NIH3T3等,原代细胞MEF；超速离心浓缩的病毒能够高效感染小鼠胚胎干细胞系D3和Zju-J1,感染效率全部可以达到90%以上,通过亚克隆筛选建立稳定的干扰细胞系。此高效慢病毒感染系统的建立为深入研究mES基因功能奠定了基础。干扰了EGFP HEK293T细胞的绿色荧光蛋白基因,干扰效率达到87.4%。也能高效干扰mES GD3的绿色荧光蛋白的表达。针对DUSP5基因,设计了3条shRNA序列,筛选得到一条具有显著的干扰效果的shRNA序列,在mES细胞内其干扰效率为59.3%。针对DUSP1基因,设计了2条shRNA序列,筛选得到一条具有显著的干扰效果的shRNA序列,在mES细胞内其干扰效率达到90.5%。针对AIRE基因,设计了4条shRNA序列,筛选得到一条具有显著干扰效果的shRNA序列,在mES细胞内其干扰效率最高可达74.3%亚克隆筛选得到DUSP5基因干扰的mES D3单克隆细胞系,DUSP5干扰的细胞的Nanog表达量下调,ERK磷酸化水平上升,这与DUSP5作为ERK专一去磷酸化功能一致,提示DUSP和mES自我更新有关。建立了DUSP1基因干扰的mES D3细胞系,发现DUSP1干扰会造成DUSP5表达量的降低,DUSP5干扰也会造成DUSP1表达量的降低,两者在mES中存在联动关系。AIRE基因干扰的mES D3细胞系的Nanog、Oct4表达水平均出现显著下降；克隆形成率、增殖速度都明显降低；细胞周期的S期明显减少,G2/M期细胞显著增加,出现多倍体增加现象。证明了AIRE基因参与维持mES细胞自我更新及细胞周期。综上所述,本研究建立了高效的慢病毒RNA干扰系统,成功应用于包括mES细胞在内的多种细胞。在小鼠ES中成功干扰DUSP5、AIRE等基因,发现DUSP5和AIRE可能与ES细胞的自我更新有关,为ES自我更新的分子机理提供了新的研究线索。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略词表  10-12
目次  12-13
第一章 文献综述  13-51
  1.1 引言  13-14
  1.2 mESC的自我更新能力  14-18
  1.3 Erk信号通路与mESC维持自我更新  18-23
  1.4 DUSP5对Erk的负反馈调节功能  23-27
  1.5 Aire基因调控的组织特异性基因异位表达  27-29
  1.6 真核细胞的基因转运系统  29-33
  1.7 慢病毒介导的RNAi技术  33-39
  1.8 小结和展望  39-40
  参考文献  40-51
第二章 慢病毒介导的RNAi系统的建立  51-97
  2.1 引言  51-52
  2.2 材料  52-54
  2.3 方法  54-64
  2.4 结果  64-92
  2.5 讨论和展望  92-95
  参考文献  95-97
第三章 DUSP5等mES自我更新相关基因的RNA干扰  97-125
  3.1 引言  97-98
  3.2 材料  98-99
  3.3 方法  99-105
  3.4 结果  105-120
  3.5 讨论与展望  120-122
  参考文献  122-125
博士论文创新点  125-127
附录  127-133
致谢  133-135
作者简历  135

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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