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表皮生长因子（EGF）、褪黑素（Melatonin）对神经干细胞增殖和迁移的实验研究

作　者: 段发亮
导　师: 陈俊抛
学　校: 第一军医大学
专　业: 神经内科
关键词: 神经干细胞增殖分化迁移表皮生长因子（EGF）褪黑素（MT）突起 Nestin抗原细胞球培养自我更新星形胶质细胞纤维酸性蛋白（GFAP）神经丝（NF）
分类号: R741.02
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

神经干细胞(Neural stem cell)是指一类具有多分化潜能(能分化为神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞)，能自我更新的细胞。具有以下特点：1、在整个生命过程中能够自我维持和自我更新。2、能自我复制。3、能够通过扩增得到大量的后代。4、具有多分化潜能。由于以前的神经干细胞多来自胎儿或胚胎组织，不仅来源少，而且受到伦理道德的影响，因此其应用也受到了一定的限制；自Reynolds BA 1992年从成年哺乳动物体内培养出神经干细胞、提出成年人体内也存在干细胞以来，有关干细胞的研究才成为国内外学者研究的热点。由于神经干细胞具有多分化潜能，能够携带外源性治疗基因，且可通过导入原癌基因获得永生细胞系等诸多优点，因而使神经干细胞移植成为治疗神经退行性疾病的一个重要手段，应用前景广阔。尽管神经干细胞具有以上优点，但移植后的神经干细胞如何按人们预想的那样增殖并分化为神经细胞、星形胶质细胞以及少突胶质细胞仍然不是很清楚。虽然神经干细胞增殖和分化方向主要取决于其在神经管中的最初定位以及从神经管迁移后在大脑中的最终定位，但其增殖和分化同时也受细胞内外环境等诸多因素的影响。褪黑素是一种主要由松果体分泌的吲哚类激素，具有昼低夜高的规律性变化。在人体内，褪黑素具有广泛的生理功能，能够维持昼夜节律，促进睡眠，增强人体免疫功能，抑制肿瘤细胞生长，清除自由基，抑制一氧化氮合成酶(NOS)的活性，防止脂质过氧化，维持和活化巨噬细胞／小胶质细胞功能，保护星形胶质细胞免受缺氧再给氧所导致的伤害，抑制高钾、谷氨酸(Glu)诱发的一氧化氮对大脑神经元的损伤，促进青春期发育，且能够防止衰老。近年来发现褪黑素在某些退行性疾病的发病机理中起到了重要的作用(如Alzheimer病)。本实验通过提取13-16天SD大鼠胚胎的纹状体细胞，分对照组、实验组1、2、3组。对照组为基本培养基(包括DMEM-F12、胎牛血清和B27)；实验1组为基本培养基加上褪黑素(MT)；实验2组为基本培养基加上表皮生长因子(EGF)；实验3组为基本培养基加上EGF 和MT。培养七天后取出漂浮的细胞球。未吹打的细胞球继续在EGF长期作用一个月；吹打成单细胞悬液的分为对照组，实验组1、2、3组。方法同上。实验结果： 1．EGF、EGF＋MT组原代培养的胎鼠纹状体细胞，第H天倒置显微镜下观察，细胞分为贴壁和漂浮两层；贴壁细胞层可观察到贴壁的10 个左右细胞的细胞克隆（40 X视野下含 5士二个细胞球），少量神经细胞、星形胶质细胞和成纤维细胞；漂浮的细胞层第二天可观察到细胞出芽、有的细胞增殖成 2－4个不等的细胞球（40 X视野下含二土 1个细胞球）； 3—5天细胞球所含细胞的数量不断增加。第六天贴壁的细胞球（每个细胞球的细胞数量约为30－40不等）开始分化；漂浮的细胞球则多由10－16 个细胞组成。第七天贴壁的细胞球基本上完全分化，而漂浮的细胞球则继续增殖。EGF、EGF＋MT两组之间相比细胞球的大小和直径没有统计学差异。对照组和单纯MT组没有观察到细胞增殖。二．漂浮的细胞球制成单细胞悬液传代培养，EGF、EGF＋MT、MT 三组传代后第二天单细胞即增殖成约10—16个细胞大小的细胞球，第三天细胞球则增殖为约30A0个细胞大小。三组之间细胞球的大小和数量并没有统计学差异。将传代后的细胞球制成单细胞悬液再传代培养仍然出现上述结果。对照组没有见到细胞增殖，分化后的细胞大量GFAP 染色阳性、少量NF染色阳性。 3．漂浮的细胞球不吹打，EGF长程作用一个月，每7天传代一次，每3天更换一次培养基，细胞球在随后的14天不断增殖，细胞球的大小在EGF作用14天时约100个细胞大小。14天后细胞球停止增殖，同时可观察到细胞球长出突起与邻近的细胞球相接触，随后的三天观察到细胞沿着长出的突起向邻近的细胞球迁移，且如果两细胞球之间的距离过远，则细胞迁移到中间会增殖成新的细胞球：17天后细胞迁移减少，突起逐渐增粗并贯穿细胞球，之后细胞处于静止状态，未再观察到细胞迁移和突起的生长 4．免疫组化：原代中贴壁细胞球、漂浮细胞球、传代培养中漂浮细胞球以及长程作用后迁移的细胞Nestin抗原反应阳性。传代后对照组中的细胞绝大多数是星型胶质细胞纤维酸性蛋白（GFAP）抗原阳性，少一3 一量神经丝（NF）抗原阳性。通过本实验，基本上掌握了神经前体细胞的培养方法和技巧。了解了褪黑素的新的功能：即褪黑素能够刺激EGF作用后的神经前体细胞增殖，能够部分替代EGF的功能

全文目录

中英文名词对照与缩写  4-5
中文摘要  5-8
英文摘要  8-11
前言  11-13
材料与方法  13-18
结果  18-19
讨论  19-27
小结  27-28
参考文献  28-31
致谢  31-32
图片说明  32-41
综述1  41-49
综述2  49-56
发表文章目录  56

表皮生长因子（EGF）、褪黑素（Melatonin）对神经干细胞增殖和迁移的实验研究

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