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甜菜夜蛾信息素结合蛋白的表达动态及其受交配和钟基因沉默的影响

作　者: 牛小慧
导　师: 董双林
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 甜菜夜蛾信息素结合蛋白生物钟基因 RNA干扰
分类号: S433.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

昆虫在长期的进化过程中,形成了复杂的化学感受机制。通过各种化学感受器,昆虫可以识别环境中大量化学信息,并做出相应的生理和行为反应,如寻找配偶、食物源、栖息和产卵场所、逃避天敌等。昆虫特别是蛾类昆虫两性间的化学通讯具有高度的灵敏性和种特异性,将其应用于害虫的行为调控已成为害虫防治的一个重要发展方向。信息素结合蛋白(pheromone binding protein, PBP)在两性昆虫间的化学通讯中起重要作用,深入研究PBP的作用机制,有助于开发更为高效的两性间化学通讯阻断剂或干扰剂。本文针对重要农业害虫甜菜夜蛾,在实验室前期研究的基础上,进一步测定了3个PBP基因的表达动态,研究了交配对PBP表达的影响,并就生物钟基因对PBP表达的调控进行了探讨。研究结果如下：1甜菜夜蛾3个PBP的时间表达动态及雌雄差异利用qRT-PCR技术测定了甜菜夜蛾3个PBP的时、日表达动态及雌雄间差异。在同一日龄(光周期)内,PBP1和PBP2的表达量均在暗期中后期升高,并在暗期末达到高峰,光期开始后逐渐下降,但除PBP1在D10h的表达量显著较高外,其他时间点间并无显著差异；PBP3在整个光周期未有显著变化。对不同日龄雄蛾的测定结果显示,3个PBP的日表达动态基本一致,表达量在蛹末期很低,羽化后随日龄的增加逐渐上升,在3日龄达到高峰,随后有所下降,但仍保持较高水平。雌雄虫相比较,PBP1在雄虫中的表达量显著高于雌虫,前者是后者的7倍左右；PBP2与PBP3则在雌虫的表达高于雄虫。3个PBP相比较,雄虫中PBP1显著较高,10倍于PBP2和PBP3的表达量；但在雌虫中,3个PBP间没有显著差异。研究结果为进一步的功能分析提供了资料。2交配对甜菜夜蛾3个PBP及受体OR2表达的影响昆虫两性间的信息素通讯以完成交配为结果。为探讨交配对性信息素通讯影响的机制,采用qRT-PCR技术研究了交配对甜菜夜蛾触角内信息素结合蛋白(PBP)和受体(OR)表达量的影响。结果显示,无论是雌虫还是雄虫,交配对3个PBP基因及受体基因OR2的表达量均未有显著影响,说明雌雄蛾对性信息素的感受能力可能不受交配经历的影响,这一结果与甜菜夜蛾的多次交配习性相一致。3甜菜夜蛾6个生物钟基因的分子克隆及昼夜表达动态生物钟基因在生物体适应环境并维持正常活动中起重要作用。本研究通过分析甜菜夜蛾的转录组数据获得了6个生物钟基因片段,然后利用RACE技术克隆了它们的cDNA全序列,经序列分析并与已知昆虫生物钟基因的序列比对,分别命名为SexiClk, SexiPer, SexiTim, SexiDbt, SexiCryl, SexiCry2.此外,利用qRT-PCR技术研究了6个基因的昼夜表达动态,发现Per和Tim相似,均在光期后期开始上升并在光期末期达到高峰,在暗期保持较高水平；Cryl和Cry2的表达量均呈U型变化,但相对表达量明显不同,在光期为Cryl>Cry2,暗期为Cry2>Cry1；C1k基因表达量在光期较高,在暗期明显较低；相对而言,Dbt的表达量在一个光周期内变化较小,略呈W型。4生物钟基因Cry2沉默后对PBP1表达的影响为了探讨生物钟基因对PBP表达的可能调控作用,利用dsRNA注射法,研究了甜菜夜蛾Cry2基因沉默后对Cry1和PBP1基因表达的影响。初步结果表明,在dsRNA注射后48小时当Cry2表达量被抑制20%时,Cry1的表达量显著上升,说明Cry2的表达抑制Cry1的表达；同时,PBP1的表达量和注射dsGFP处理相比显著下降,但和注射DEPC水及不注射对照相比,虽有下降(约10%)但不显著。

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摘要 7-9ABSTRACT 9-12第一章文献综述 12-20 1 昆虫信息素结合蛋白概述 12-13 2 昆虫信息素结合蛋白的表达特性 13-14 2.1 信息素结合蛋白的表达时间和部位 13 2.2 信息素结合蛋白表达的性别差异 13-14 3 昆虫信息素结合蛋白的生理功能 14 4 生物钟基因研究进展 14-19 4.1 昆虫生物钟相关基因及其蛋白 15-17 4.2 生物钟的分子机制 17-18 4.3 环境因素对生物钟的影响 18-19 5 本研究的目的和意义 19-20第二章甜菜夜蛾3个信息素结合蛋白基因的表达动态及雌雄差异 20-32 1 材料与方法 21-25 1.1 供试昆虫及材料收集 21 1.2 主要试剂和仪器设备 21-22 1.2.1 主要试剂 21-22 1.2.2 主要仪器设备 22 1.3 昆虫总RNA的提取 22-23 1.4 cDNA第一链的合成 23-24 1.5 PCR引物设计 24 1.6 实时荧光定量PCR反应 24-25 1.7 实时荧光定量PCR扩增效率的确定 25 1.8 甜菜夜蛾PBP基因mRNA表达量比较 25 1.9 数据分析 25 2 结果与分析 25-29 2.1 同一日龄不同时间的表达量 25-27 2.2 不同日龄的表达量 27-28 2.3 雌雄间的相对表达量 28-29 3 讨论 29-32第三章交配对甜菜夜蛾3个PBP及受体OR2表达量的影响 32-38 1 材料与方法 32-33 1.1 供试昆虫 32-33 1.2 交配实验 33 1.3 主要试剂及仪器 33 1.4 昆虫总RNA提取 33 1.5 cDNA第一链的合成 33 1.6 PCR引物 33 1.7 实时荧光定量PCR反应 33 1.8 数据分析 33 2 结果与分析 33-35 3. 讨论 35-38第四章甜菜夜蛾生物钟基因的分子克隆及昼夜表达动态 38-52 1 材料与方法 39-45 1.1 供试昆虫及材料收集 39 1.2 主要试剂和仪器设备 39 1.2.1 主要试剂 39 1.2.2 主要仪器设备 39 1.3 昆虫总RNA的提取 39 1.4 PCR引物设计 39-40 1.5 RACE扩增基因的cDNA 40-42 1.5.1 5'-RACE cDNA的合成 41 1.5.2 3'-RACE cDNA的合成 41-42 1.6 PCR产物纯化、克隆、测序和序列分析 42-45 1.6.1 PCR产物纯化 42-43 1.6.2 连接反应 43 1.6.3 转化反应 43-44 1.6.4 挑斑 44 1.6.5 小量质粒DNA的提取 44 1.6.6 序列测定 44-45 1.6.7 序列分析 45 1.7 生物钟基因表达量的测定 45 2 结果与分析 45-48 2.1 生物钟基因全长cDNA克隆及其序列分析 45-47 2.2 生物钟基因的昼夜表达动态 47-48 3 讨论 48-52第五章生物钟基因CRY2沉默对PBP1表达的影响 52-58 1 材料与方法 52-54 1.1 供试昆虫及材料收集 53 1.2 主要试剂及仪器 53 1.3 昆虫总RNA提取 53 1.4 dsRNA的合成 53-54 1.4.1 PCR引物 53 1.4.2 PCR扩增 53 1.4.3 回收纯化 53-54 1.4.4 dsRNA合成 54 1.5 虫体注射 54 1.6 荧光定量PCR 54 1.7 数据分析 54 2 结果与分析 54-56 3 讨论 56-58全文总结 58-60参考文献 60-70攻读硕士学位期间学术论文的发表情况 70-72致谢 72

甜菜夜蛾信息素结合蛋白的表达动态及其受交配和钟基因沉默的影响

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