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灰飞虱功能基因的克隆及其RNAi致死效应

作 者: 贺秀婷
导 师: 董双林
学 校: 南京农业大学
专 业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 灰飞虱 功能基因 全长cDNA克隆 qRT-PCR 内参基因 表达稳定性 RNA干扰 致死效应
分类号: S435.112.3
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


灰飞虱(Laodelphax striatellus)是我国粮食作物上的一种重要害虫,它不仅刺吸取食水稻等禾本科植物的汁液造成直接危害,而且还能传播病毒引起水稻条纹叶枯病和灰条矮缩病等。自20世纪60年代大发生之后,经过几十年的潜伏期,灰飞虱在90年代后期又一次暴发并持续至今,并导致2000年以来条纹叶枯病在江淮稻区日益严重。目前对灰飞虱的防治主要以化学防治为主,由于长期使用化学农药,不仅造成了严重的环境污染,也使得灰飞虱的抗药性增强,因此急需研究和开发新的灰飞虱防治技术。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种由双链RNA诱发的转录后水平的基因沉默现象,广泛存在于真菌、植物和动物中。基于RNAi原理,通过转基因技术,使寄主作物或杀虫微生物表达害虫重要功能基因的dsRNA,就可以使害虫在取食作物或被微生物侵染后,自身功能基因表达受阻从而达到害虫控制的目的。这一害虫防治新策略已经引起世界范围内的极大关注。为了探讨基于RNAi策略的灰飞虱防治新技术,本文利用灰飞虱转录组数据并采用RACE技术,对灰飞虱一些重要功能基因进行了全长克隆;在此基础上,利用喂食法对这些基因对灰飞虱的RNAi致死效应进行了测定;此外,为了筛选合适的qRT-PCR用灰飞虱内参基因,还对几个灰飞虱持家基因的表达稳定性进行了分析。主要研究结果如下:1.通过灰飞虱转录组数据分析并结合RACE技术,克隆了12个灰飞虱基因的5’端和7个基因的全长cDNA序列。7个全长序列包括tubulin基因3个、ADP核糖基化因子基因(ARF)、60s核糖体蛋白L9基因(RPL9)、糖转运因子(ST)和保幼激素结合蛋白基因(JHBP)各1个,分别命名为LstrTUB1 (Genbank登录号:JF728809)、LstrTUB2 (Genbank登录号:JF728810)、LstrTUB3 (Genbank登录号:JF728811)、LstrARF(Genbank登录号:JF728807)、LstrRPL9(Genbank登录号:JF728806)、LstrST (Genbank登录号:JN050856)及LstrJHBP (Genbank登录号:JF728808)。片段及全长cDNA的克隆为基因功能、RNAi致死效应等研究奠定了基础。2.通过dsRNA喂食法,测定了15个功能基因对2龄灰飞虱若虫的RNAi致死效应。结果表明,其中CHI7、RPL9-2、ST等7个基因的效果较好,处理120h后平均校正死亡率在40%以上,以CHI7最高达64%; ATPase和a2-TUB效果较差,平均校正死亡率在20%以下;其他6个基因居中,校正死亡率在20-40%间。以CHI7为例进行的qRT-PCR检测表明,dsRNA处理后72h CHI7的表达量下降了57%,说明本RNAi方法的有效性。这是首次在灰飞虱中实现了RNAi,该方法的建立及对不同基因的测定结果为基于RNAi的灰飞虱防治技术提供了基础。3.对克隆得到的灰飞虱保幼激素结合蛋白基因LstrJHBP,进一步就该基因的归类、表达动态及对灰飞虱若虫的RNAi致死效应进行了研究。综合信号肽预测、氨基酸序列比对及进化分析结果,认为LstrJHBP是一个细胞质JHBP。利用qRT-PCR的测定表明,LstrJHBP在灰飞虱若虫5个龄期及雌雄成虫均有表达,但4龄若虫期显著高于其他龄期;雌雄成虫间没有显著差异。以喂食法对2龄若虫进行的RNAi实验的结果表明,当dsRNA的喂食浓度为56.65ng/ul并连续喂食5天,处理组的若虫死亡率与对照间没有显著差异。4.灰飞虱中qRT-PCR常用的内参基因是β-肌动蛋白(β-Actin),但实验表明其稳定性并不很好。为了确定合适的灰飞虱内参基因,在克隆到5个持家基因全长cDNA序列基础上,进一步对该5个持家基因(3个tubulin基因、ADP核糖基化因子基因和60s核糖体蛋白L9基因各1个)及β-Actin在灰飞虱若虫不同龄期的表达量进行了测定,并利用geNorm及NormFinder软件进行了表达稳定性分析。研究表明,在灰飞虱中ARF和RPL9的稳定性高于β-Actin,可以作为替代内参基因;并且,当ARF和RPL9同时使用时,所得定量结果的误差更小。

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摘要  7-9ABSTRACT  9-11第一章 文献综述  11-27  1 灰飞虱的发生及危害  11-15    1.1 灰飞虱的生物学特性  11-12    1.2 灰飞虱的分布及生活史  12    1.3 灰飞虱的发生规律和危害特点  12-13    1.4 灰飞虱大发生的原因  13-15  2 灰飞虱的防治策略及其研究进展  15-17    2.1 灰飞虱的防治策略  15    2.2 国内外研究动态  15-16    2.3 昆虫生长调节剂-保幼激素及其受体在防治L的研究利用  16-17  3 实时荧光定量PCR及内参基因的选择  17-19  4 RNA干扰技术的研究及应用  19-23    4.1 RNA干扰的定义  19    4.2 RNA干扰的分子机理  19-21    4.3 RNA干扰技术的应用现状  21-22    4.4 RNA干扰技术的研究进展  22-23  5 喂食法在RNA干扰研究中的应用  23-26    5.1 dsRNA向虫体内的导入方法及其优缺点  23-25    5.2 dsRNA喂食法的应用前景  25-26  6 本研究的目的和意义  26-27第二章 灰飞虱功能基因的片段获得及全长克隆  27-44  1 材料与方法  28-34    1.1 主要试剂  28    1.2 主要仪器设备  28-29    1.3 灰飞虱功能基因的片段获得  29    1.4 灰飞虱功能基因的全长克隆  29-34  2 结果与分析  34-43    2.1 通过转录组数据获得的片段  34-36    2.2 全长克隆  36-43  3 讨论  43-44第三章 灰飞虱功能基因RNAI的致死效应  44-62  1 材料和方法  45-49    1.1 供试昆虫  45    1.2 主要试剂和仪器  45    1.3 dsRNA合成  45-46    1.4 dsRNA喂食实验  46-47    1.5 dsRNA致死效果的剂量效应  47    1.6 dsRNA喂食后目标基因RNA的定量PCR测定  47-49  2 结果  49-60    2.1 dsRNA对灰飞虱若虫的致死效果  50-58    2.2 dsRNA喂食灰飞虱的剂量效应  58-59    2.3 qRT-PCR分析  59-60  3 讨论  60-62第四章 灰飞虱保幼激素结合蛋白基因LstrJHBP的表达动态及RNAI致死效应  62-72  1 材料和方法  63-66    1.1 供试昆虫  63    1.2 主要试剂和仪器  63    1.3 JHBP表达量的qRT-PCR测定  63-65    1.4 JHBP dsRNA干扰试验  65-66  2 结果与分析  66-70    2.1 LstrJHBP与其他昆虫同源基因的相似性及聚类分析  66-69    2.2 LstrJHBP随若虫不同龄期的表达动态及雌雄差异  69    2.3 JHBP-dsRNA干扰试验  69-70  3 结论与讨论  70-72第五章 灰飞虱6个持家基因的表达稳定性分析  72-80  1 材料与方法  72-74    1.1 供试昆虫  72-73    1.2 持家基因的表达稳定性实验  73-74    1.3 灰飞虱内参基因的验证  74  2 结果与分析  74-78    2.1 6个持家基因的引物验证  74-76    2.2 6个持家基因的Ct值变异范围  76    2.3 6个持家基因的稳定性分析  76-77    2.4 优选内参基因的验证  77-78  3 讨论  78-80全文总结  80-82参考文献  82-92攻读硕士学位期间学术论文的发表情况  92-94致谢  94

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 虫害 > 稻虱
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