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BnABP1 cDNA遗传转化及在植物特定细胞中的过表达

作　者: 彭珍子
导　师: 张学文
学　校: 湖南农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 生长素结合蛋白cDNA 棉花E6基因启动子 遗传转化 细胞伸长
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


生长素结合蛋白(Auxin Binding Protein, ABP1)对植物响应生长素信号的细胞伸长生长起重要调节作用。前期我们已克隆了苎麻生长素结合蛋白基因cDNA (BnABP1)。为了进一步了解苎麻生长素结合蛋白ABP1的功能及作用,克隆了在伸长生长特征细胞内高表达基因——棉花纤维细胞高表达E6基因的启动子,将E6基因启动子与BnABP1 cDNA重组后分别转化拟南芥和棉花,初步研究了BnABP1对植物细胞伸长的作用。为了验证棉花E6基因启动子的表达效果,我们首先将其与报告基因GUS(编码β-葡萄糖苷酸酶)重组后转入拟南芥中。转化苗经GUS显色表明,转基因拟南芥表皮毛、花器、茎秆和幼根中均有少量的蓝色呈现,但是叶片表皮毛中蓝色最为明显,说明E6启动子控制基因在拟南芥的表皮毛中有优势表达。利用Ti质粒pBIl21为出发载体,构建了由E6启动子调控BnABP1基因的植物表皮毛过表达载体pBI121-E6-BnABP1。将其转入根癌农杆菌GV3101后经浸花序法转化哥伦比亚型拟南芥,获得了3株阳性转基因植株。显微观察和统计分析表明转基因拟南芥叶片的表皮毛(trichome)长度较对照平均伸长约10%。说明由E6启动子驱动的BnABP1在拟南芥的表皮毛细胞中能过表达后,可以一定程度促进细胞的伸长生长。植株生长量包括叶盘大小、茎杆高度和抽薹数都有增长。而且过表达还可以影响表皮毛的启动和发育,表现为叶表皮毛的密度增加,更加均匀浓密。这为ABP1是生长素调控植物生长发育的关键蛋白提供了新证据。作为平行性研究,利用已构建的载体还对棉花进行了遗传转化。采用根癌农杆菌子房注射法,将工程化农杆菌直接注射授粉前后的棉花子房,对8个基因型的棉花进行了遗传转化,先建立了一条较前人方法更为高效的棉花植株活体遗传转化的技术路线。采用考马斯亮蓝标记的注射表明,注射细菌液在棉花授粉前48 h (-2DPA)至24 h (1DPA)都可以进入珠胚中,考虑到注射对授粉的影响,活体转化在授粉24 h时经花粉管通道注入5μL约104细菌,在8个基因型的材料中都筛选出了阳性的转基因植株。但由于受时间限制,转基因棉花的纤维品质和发育还在进一步研究中。

全文目录


中文摘要  6-7
Abstract  7-9
第一章 文献综述  9-22
  1 生长素结合蛋白ABP1  9-14
    1.1 ABP1的结构  9-11
    1.2 ABP1的亚细胞定位  11
    1.3 ABP1基因  11-12
    1.4 ABP1的分子机制  12-14
  2 拟南芥的表皮毛  14-19
    2.1 表皮毛的结构形态  14-15
    2.2 表皮毛的发育  15-19
  3 棉花纤维  19-21
  4 纤维优势表达启动子E6  21-22
第二章 E6启动子的克隆  22-29
  1 材料与试剂  22
    1.1 植物材料  22
    1.2 菌株  22
    1.3 酶与试剂盒  22
    1.4 试剂  22
  2 实验方法  22-26
    2.1 棉花幼苗的获得  22
    2.2 用CTAB法获得棉花总DNA  22-23
    2.3 用PCR法获得E6启动子  23
    2.4 回收E6启动子片段  23-24
    2.5 将回收的E6启动子片段克隆到pMD18载体上  24
    2.6 大肠杆菌细胞感受态的制备及转化  24-25
    2.7 E6启动子的鉴定及序列测定  25-26
  3 实验结果与分析  26-29
    3.1 棉花总DNA的提取  26
    3.2 E6启动子的扩增及克隆检测  26-27
    3.3 启动子序列分析  27-29
第三章 BnABP1组织增强表达载体的构建  29-37
  1 材料与试剂  29
    1.1 菌株与质粒  29
    1.2 工具酶及主要试剂  29
  2 实验方法  29-33
    2.1 检测纤维组织增强表达pBI121-E6-GUS载体的构建  29-31
    2.2 pBI121-E6-BnABP1纤维组织增强表达载体的构建  31-33
  3 结果与分析  33-36
    3.1 检测纤维增强表达载体pBI121-E6-GUS的构建  33-34
    3.2 纤维组织增强表达载体pBI121-E6-BnABP1的构建  34-36
  4 讨论  36-37
第四章 特异性表达载体对拟南芥的转化  37-47
  1 材料与试剂  37
    1.1 菌株  37
    1.2 植物材料  37
    1.3 主要试剂  37
  2 实验方法  37-40
    2.1 农杆菌感受态细胞的制备  37
    2.2 检测载体和增强表达载体对农杆菌的转化  37
    2.3 农杆菌阳性检测  37-38
    2.4 拟南芥的种植  38
    2.5 拟南芥的活体转化  38-39
    2.6 GUS染色  39-40
  3 结果与分析  40-47
    3.1 拟南芥的种植  40
    3.2 抗性植株的第一次筛选  40
    3.3 抗性植株的纯合体筛选  40-41
    3.4 分子检测  41
    3.5 GUS染色分析  41-42
    3.6 苎麻生长素结合蛋白表达结果分析  42-47
第五章 组织增强表达载体对棉花的活体转化  47-54
  1 材料与试剂  47
  2 实验方法  47-48
    2.1 农杆菌感受态细胞的制备  47
    2.2 检测载体和组织增强表达载体对农杆菌的转化  47
    2.3 农杆菌阳性检测  47
    2.4 棉花的活体转化  47-48
  3 结果与分析  48-54
    3.1 菌液注射时间的确定  48-49
    3.2 卡那霉素的田间检测  49-50
    3.3 分子检测  50-51
    3.4 农杆菌介导转化法讨论  51-54
第六章 总结  54-55
参考文献  55-61
附录A: E6启动子序列测序报告  61-62
附录B: 缩略词表  62-63
附录C: 主要试剂配置  63-65
致谢  65-66
作者简介  66

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学
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