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RS基因表达载体构建及遗传转化果蔗的初步研究

作　者: 方珊茹
导　师: 陈如凯
学　校: 福建农林大学
专　业: 作物栽培学与耕作学
关键词: 白藜芦醇合酶基因表达载体果蔗遗传转化
分类号: S566.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

白藜芦醇（Res）是一种重要的植物抗菌素，具有多种医疗保健作用，因此其应用前景非常广泛，已引起多方关注。白藜芦醇合酶（RS）是Res生物合成的关键酶之一，它催化1分子4-香豆酰辅酶A和3分子丙二酰辅酶A反应合成Res。关于它的研究已广泛开展起来。果蔗是一种高生物产量的作物，但其面临着病虫害严重和品质较差等问题。基因工程方法可将有用的外源基因导入果蔗，从而改善果蔗的品质，提高经济价值。同时若以之为生物反应器用于表达一些医药蛋白将具有优越性和广阔的应用前景。本研究拟以花生中克隆的RS基因为基础，构建Ubi启动子的单子叶植物表达载体和酵母表达载体，并对果蔗的再生体系进行优化，利用基因枪法尝试将RS基因转导果蔗，初步建立了果蔗的遗传转化体系。主要研究结果如下： 1、成功构建了RS基因的以Ubi为启动子的单子叶植物表达载体pBIL-RS，为遗传转化果蔗和其他单子叶植物提供条件。 2、成功构建了酵母表达载体pVT102U-RS，为下一步研究真核表达蛋白的生物活性提供条件，并为利用酵母生产Res提供了可能。 3、对果蔗的再生体系进行优化，优化后的诱导培养基为MS+2，4-D 2mg．L^-1；分化培养基为MS+NAA 0.2mg．L^-1+BA 2 mg．L^-1；促根培养基为1／2 MS+NAA 2mg．L^-1；在分化和促根培养基中添加活性碳0.5g．L^-1，以减少酚类毒害及促进生根。 4、选用G418抗生素对果蔗愈伤组织继代、分化、促根阶段进行抗性预试验，确定继代和分化阶段的筛选浓度为30mg．L^-1，促根阶段的筛选浓度为25mg．L^-1。 5、利用基因枪法尝试将构建的单子叶植物表达载体pBIL-RS导入果蔗：目前，已获得抗性再生苗；初步建立了果蔗的遗传转化体系。

全文目录

中文摘要  6-7
英文摘要  7-8
文献综述  8-27
  1 白藜芦醇合酶的研究进展  8-19
    1.1 Res的结构及性质  9
    1.2 Res的存在与分布  9-10
    1.3 Res的制备  10-11
    1.4 Res的药理活性  11-14
    1.5 RS的诱导  14-16
    1.6 RS基因的分子生物学研究  16-19
  2 酵母基因表达系统  19-21
    2.1 酵母基因表达系统概况  19
    2.2 酵母表达的优点  19
    2.3 酵母菌的宿主系统  19-20
    2.4 酵母菌的载体系统  20
    2.5 酵母菌的转化方法  20
    2.6 酵母的表达系统  20-21
  3 甘蔗遗传转化研究  21-25
    3.1 甘蔗的遗传转化方法  22-24
    3.2 影响甘蔗遗传转化的因素  24-25
  4 本研究的目的和意义  25-27
第一章 RS基因表达载体的构建  27-48
  1 材料与试剂  27-28
    1.1 材料  27-28
    1.2 试剂  28
  2 方法  28-39
    2.1 植物表达载体的构建  28-36
      2.1.1 菌种的活化  28-29
      2.1.2 pMD-18-T-RS质粒的提取、酶切鉴定  29-30
        2.1.2.1 pMD-18-T-RS连接质粒的小量提取  29
        2.1.2.2 酶切检测  29-30
      2.1.3 pBIL-1质粒提取、酶切检测  30-31
      2.1.4 目的片段和载体片段的回收与纯化  31-32
        2.1.4.1 目的片段的回收纯化  31-32
        2.1.4.2 pBIL-1质粒的酶切、补平和大片段的回收纯化  32
      2.1.5 目的片段和载体大片段的连接反应及转化大肠杆菌  32-34
        2.1.5.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  32-33
        2.1.5.2 连接反应  33
        2.1.5.3 连接产物的转化  33-34
      2.1.6 筛选重组子  34-35
        2.1.6.1 重组质粒PCR检测  34-35
        2.1.6.2 酶切鉴定  35
      2.1.7 质粒的大量提取  35-36
    2.2 酵母表达载体的构建  36-39
      2.2.1 引物的设计  36
      2.2.2 表达质粒pVT102U/a-RS的构建  36-37
        2.2.2.1 pMD18T-RS~+和pVT102U／a质粒的小量提取、酶切鉴定  36-37
        2.2.2.2 载体片段的回收纯化  37
        2.2.2.3 连接反应及重组子的鉴定  37
      2.2.3 重组质粒转化酵母  37-38
        2.2.3.1 酵母感受态细胞的制备  37-38
        2.2.3.2 酵母转化  38
      2.2.4 酵母转化子的PCR鉴定  38-39
  3 结果与分析  39-47
    3.1 植物表达载体的构建  39-44
      3.1.1 pMD-18T-RS、pBIL-1质粒酶切鉴定  40-41
      3.1.2 目的片段和载体大片段的回收及纯化  41
      3.1.3 重组质粒PCR、酶切鉴定  41-44
    3.2 酵母表达载体构建的结果  44-47
      3.2.1 DMD18T-RS~+、pVT102U／a酶切鉴定  44-45
      3.2.2 载体片段的回收与目的片段的连接  45-46
      3.2.3 酵母转化子的PCR鉴定  46-47
  4 讨论  47
  5 小结  47-48
第二章果蔗遗传转化体系的初步研究  48-58
  1 材料与试剂  48
    1.1 植物材料  48
    1.2 仪器和试剂  48
  2 方法  48-51
    2.1 果蔗再生体系的优化  48-49
      2.1.1 培养基  48
      2.1.2 培养方法  48-49
      2.1.3 试验处理  49
    2.2 基因枪法转化果蔗  49-51
      2.2.1 转化材料的抗性筛选预试验  49
      2.2.2 转化材料的预处理  49-50
      2.2.3 微弹的制备  50
      2.2.4 转化材料的轰击  50-51
      2.2.5 转化材料的过渡培养和选择培养  51
  3 结果与分析  51-56
    3.1 果蔗再生体系的优化  51-53
      3.1.1 2，4-D对愈伤组织诱导的影响  51
      3.1.2 BA对愈伤组织分化的影响  51-53
      3.1.3 NAA对生根培养的影响  53
    3.2 抗性筛选预试验的结果  53-55
    3.3 基因枪法转化果蔗的结果  55-56
  4 讨论  56-57
  5 关于后续工作  57
  6 小结  57-58
致谢  58-59
参考文献  59-66
附录1 缩略词及英汉对照  66-68
附录2 主要溶液的配制  68-69
附录3 培养基的配制  69-70
附录4 白藜芦醇合酶基因序列  70

RS基因表达载体构建及遗传转化果蔗的初步研究

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