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新疆沙冬青（Ammopiptanthus nanus）抗寒相关基因的分子克隆及表达分析

作　者: 黄国涛
导　师: 钟鸣；郭志富
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 沙冬青 抗寒相关基因 分子克隆 原核表达 真核表达载体构建
分类号: S793.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本研究以抗寒性极强的新疆沙冬青为材料,克隆得到了抗寒相关的酶蛋白基因AnGPAT全序列和抗逆转录因子基因AnICEa和AnICEb的部分序列,并对各基因进行了序列分析及分子进化分析,同时对AnGPAT基因进行了原核体外表达和转基因载体构建。为不同抗寒基因的协同作用机制研究,以及抗逆新基因的发掘与基因工程育种奠定了基础。主要结果如下：1.经同源克隆和RACE方法成功克隆了新疆沙冬青GPAT基因的cDNA全序列,命名为AnGPAT。其基因全长1482 bp, ORF长1380 bp,编码一个由460个氨基酸残基组成的多肽。对该基因编码的氨基酸进行分析,预测分子量为50.9KD,等电点为7.38。保守性功能区搜索发现从201到436位氨基酸残基为GPAT保守功能域(LPLATs)。进化分析表明,AnGPAT与蚕豆(Vicia faba)和油棕(Elaeis guineensis) GPAT蛋白亲缘关系最近。2.经同源克隆和染色体步移技术获得了两个同源ICE基因,分别命名为AnICEa和AnICEb.在两基因中都发现了ICE基因保守功能域bHLH。对不同物种ICE基因编码的氨基酸全序列和C端序列同源比对后进化分析表明：AnICEa与大豆(Glycine max) ICE蛋白聚为一类,AnICEb与萝卜(Raphanus sativus),拟南芥(A.thaliana) ICE蛋白亲缘关系较近。3.将AnGPAT基因的开放阅读框插入表达载体pET-30 a(+)的MCS区,获得了pET-30a-GPAT大肠杆菌表达载体。转化大肠杆菌BL21后,在37℃经1 mM IPTG诱导后获得一个大约51 kDa的融合蛋白,和预测大小一致。4.通过构建中间表达载体pGM-35S-GPAT-NOS,使得AnGPAT连接上强启动子和终止子。把35S-GPAT-NOS片段插入到pCAMBIA2300的MCS区,成功构建了p2300-35S-GPAT-NOS真核表达载体。为后续利用转基因技术进行基因功能研究奠定了基础。

全文目录


摘要  12-13Abstract  13-15第一章 综述  15-25  1.1 冷胁迫和转录调控级联机制  16-19    1.1.1 冷胁迫  16    1.1.2 ICE-CBF-COR转录调控级联机制  16-19  1.2 植物抗寒基因工程  19-22    1.2.1 导入脂肪酸去饱和代谢关键酶基因的研究  19-20    1.2.2 导入抗氧化酶基因的研究  20-21    1.2.3 导入渗透调节相关基因的研究  21-22    1.2.4 导入抗寒调控基因的研究  22  1.3 沙冬青的抗逆特性研究  22-24    1.3.1 抗旱性  23    1.3.2 抗寒性  23    1.3.3 抗盐性  23-24  1.4 研究思路  24-25第二章 GPAT基因的克隆及序列分析  25-44  2.1 材料  25-26    2.1.1 植物材料  25    2.1.2 菌株与质粒  25    2.1.3 酶和试剂  25-26    2.1.4 主要仪器及生物软件  26  2.2 实验方法  26-38    2.2.1 新疆沙冬青总RNA的提取  26-27    2.2.2 反转录合成第一链cDNA  27-28    2.2.3 GPAT基因的PCR扩增  28-34    2.2.4 PCR扩增产物的胶回收  34-35    2.2.5 TA克隆  35-36    2.2.6 阳性克隆的筛选  36-37    2.2.7 序列测定与分析  37    2.2.8 GPAT全长序列的鉴定  37-38  2.3 结果与分析  38-42    2.3.1 新疆沙冬青GPAT基因的克隆  38-39    2.3.2 新疆沙冬青GPAT基因的序列分析  39    2.3.3 新疆沙冬青GPAT基因的同源性比对及分子进化分析  39-42  2.4 讨论  42-44第三章 ICE基因的克隆及序列分析  44-54  3.1 实验方法  44-48    3.1.1 植物基因组DNA的提取  44    3.1.2 同源片段的扩增和克隆  44-45    3.1.3 3' RACE  45-46    3.1.4 染色体步移获得5'片段  46-48    3.1.5 DNA序列测定与分析  48  3.2 结果与分析  48-52    3.2.1 新疆沙冬青ICE基因的克隆  48-49    3.2.2 新疆沙冬青ICEa、ICEb基因的序列分析  49-51    3.2.3 AnICEa、AnICEb基因的同源性和进化分析  51-52  3.3 讨论  52-54第四章 新疆沙冬青AnGPAT基因的原核表达  54-61  4.1 材料与方法  54-58    4.1.1 菌种和载体  54    4.1.2 酶和试剂  54    4.1.3 pET30a-GPAT原核表达载体的构建及转化  54-57    4.1.4 AnGPAT蛋白原核表达  57-58    4.1.5 SDS-PAGE电泳分析  58  4.2 结果与分析  58-59    4.2.1 pET30a-GPAT重组质粒的酶切鉴定  58-59    4.2.2 重组质粒pET30a-AnGPAT在BL21(DE3)中的诱导表达  59  4.3 讨论  59-61第五章 AnGPAT真核表达载体的构建  61-69  5.1 研究材料  62    5.1.1 菌株和质粒  62    5.1.2 主要的酶试剂及试剂盒  62    5.1.3 实验材料  62  5.2 实验方法  62-65    5.2.1 实验方案设计  62-63    5.2.2 AnGPAT的获得  63    5.2.3 CaMV 35S-GUS-NOS片段的克隆  63    5.2.4 中间载体pGM-35S-GPAT-NOS的构建  63-64    5.2.5 表达载体p2300-35S-GPAT-NOS的构建  64-65    5.2.6 农杆菌的转化  65  5.3 结果与分析  65-67    5.3.1 AnGPAT基因和CaMV 35S-GUS-NOS片段的克隆  65-66    5.3.2 中间载体pGM-35S-GPAT-NOS的构建  66    5.3.3 表达载体p2300-35S-GPAT-NOS的构建  66-67    5.3.4 转化子的鉴定  67  5.4 讨论  67-69结论  69-71参考文献  71-78攻读硕士学位期间发表文章  78-79致谢  79-80

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 阔叶灌木 > 其他
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