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河南华溪蟹重组金属硫蛋白的原核表达

作　者: 张志明
导　师: 王兰
学　校: 山西大学
专　业: 动物学
关键词: 河南华溪蟹 金属硫蛋白 表达载体pQE31/pGEX-6pl 原核表达
分类号: X174
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


金属硫蛋白(Metallothionein, MT),是一类低分子量、富含半胱氨酸、无芳香族氨基酸、能与金属结合的普遍存在于生物界的非常独特的蛋白质。具有重金属解毒、清除自由基、抗辐射、修复组织损伤、抗衰老以及调节微量元素平衡等重要作用。现有MT主要来自于动物内脏的提取物,存在重金属污染的可能,使之不能成为有效的医药蛋白资源,而其MT蛋白体外原核表达研究也不深入。因此,本论文选用河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)为材料,采用基因重组技术,对其MT在大肠杆菌中的表达进行了较为系统的比较与分析,建立了MT的体外原核表达系统,筛选获得了有效表达MT的菌株,探索了用不同表达载体表达华溪蟹MT。为研究重组MT为抗原制备多克隆抗体,以及在蛋白水平探讨MT的组织分布和细胞定位奠定了基础,为MT在环境监测及环境污染治理方面的应用开辟了途径。首先,在克隆得到河南华溪蟹MT的cDNA,将华溪蟹MTcDNA连接于T载体上得到pGEM-T-MT的基础上,将其导入大肠杆菌DH5α中,以pGEM-T-MT质粒为模板,PCR扩增目的片段,双酶切,胶回收纯化,连接至pGEM-T载体扩增,双酶切,亚克隆至pQE31载体,转入大肠杆菌BL21中。结果表明,PCR扩增目的片段产物大小符合要求,重组质粒pQE31-MT双酶切鉴定与其一致,测序结果正确。其次,在将河南华溪蟹MTcDNA连接于pQE31载体上得到pQE31-MT的基础上,将其导入大肠杆菌DH5α中,以pQE31-MT质粒为模板,PCR扩增目的片段,双酶切,胶回收纯化,连接至pGEM-T载体扩增,双酶切,亚克隆至pGEX-6p-1载体,转入大肠杆菌BL21中。结果表明,PCR扩增目的片段产物大小符合要求,重组质粒pGEX-6p1-MT双酶切鉴定与其一致。从IPTG浓度、IPTG诱导时间、金属离子浓度等几个方面摸索诱导MT表达的条件,表达出分子量约为35kD的融合蛋白。

全文目录


摘要  8-9
ABSTRACT  9-11
第一章 综述  11-25
  1 水生动物中重金属的影响  11-12
  2 镉与金属硫蛋白(MT)  12-15
    2.1 镉的理化性质  12-13
    2.2 镉的生物学作用  13
    2.3 重金属诱导金属硫蛋白研究进展  13-15
  3 大肠杆菌原核表达系统  15-19
    3.1 原核表达系统  15
    3.2 表达载体的类型及研究进展  15-17
    3.3 大肠杆菌中外源蛋白高效表达的影响因素  17-19
  4 金属硫蛋白的生理功能与研究进展  19-22
    4.1 MT的理化性质和结构特点  19-20
    4.2 MT的生物学功能  20
    4.3 MT的分类  20-21
    4.4 MT的应用  21
    4.5 MT分子生物学的研究现状及进展  21-22
  5 本文研究的目的、意义和内容  22-25
第二章 重组表达载体pQE31-MT的构建  25-37
  摘要  25
  1 实验材料  25-26
    1.1 菌种及试剂  25
    1.2 溶液  25-26
    1.3 主要仪器  26
  2 实验方法  26-31
    2.1 重组质粒构建流程图  26-27
    2.2 质粒的扩大培养  27-28
    2.3 制备目的基因MT  28-30
    2.4 表达载体和目的片段的连接  30-31
    2.5 重组表达载体的酶切鉴定  31
  3 结果  31-35
    3.1 PCR扩增MT基因片段  31-32
    3.2 pGEM-T-MT的构建  32
    3.3 pGEM-T-MT载体双酶切鉴定  32-33
    3.4 pQE31-MT载体的构建  33-34
    3.5 序列测定及分析  34-35
  4 讨论  35-36
  Abstract  36-37
第三章 重组表达载体pGEX-6p1-MT的构建及在大肠杆菌BL21中的表达  37-51
  摘要  37-38
  1 实验材料  38-39
    1.1 菌种与质粒  38
    1.2 溶液  38
    1.3 主要仪器  38-39
  2 实验方法  39-41
    2.1 重组质粒构建流程图  39-40
    2.2 MT基因扩增  40
    2.3 MT基因T载体亚克隆和酶切鉴定  40-41
    2.4 pGEX-6p1-MT融合表达载体的构建  41
    2.5 含重组MT工程菌株的表达分析及条件优化  41
  3 结果  41-46
    3.1 PCR扩增MT基因片段  41
    3.2 连接产物pGEM-T-MT与表达载体pGEX-6p-1双酶切  41
    3.3 pGEX-6p1-MT亚克隆载体的构建  41-43
    3.4 序列测定及分析  43-44
    3.5 重组蛋白的表达形式  44
    3.6 金属Zn离子诱导浓度  44-45
    3.7 不同浓度IPTG诱导表达  45-46
  4 讨论  46-49
    4.1 金属诱导  46
    4.2 表达载体的选择  46-49
  5 结论  49
  Abstract  49-51
参考文献  51-58
攻读学位期间取得的研究成果  58-59
致谢  59-60
个人简况及联系方式  60-62

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境动物学
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