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多选择标记植物表达载体的构建

作　者: 李春艳
导　师: 李有志
学　校: 广西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 小热胁迫蛋白 选择标记 绿色荧光蛋白 表达载体
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


用多选择标记植物表达载体侵染植物后,通过载体上的选择标记对植物遗传转化后的目的基因进行检测是监测功能基因、提高作物品种的多样性和适用性的常用做法。本研究以植物表达载体pCAMBIA1301为受体,克隆外源片段可溶性的红移绿色荧光蛋白(smRSGFP)基因、抗除草剂Basta的选择标记bar基因以及其下游的一个植物CaMV35S启动子到此载体上,构建出含smRSGFP、bar、β-葡萄糖苷酸酶(GUS)及潮霉素(Hpt)抗性基因的多选择标记载体。然后,从玉米中克隆出小热激蛋白(sHsp)连接到bar基因下游CaMV35S启动子上,使此载体含4个标记基因后,还携带一个功能基因。不仅在大肠杆菌,农杆菌中检测了smRSGFP基因,还在玉米中初步检测了各种标记基因及sHsp基因的表达。本研究得出以下结论：(1)绿色荧光蛋白基因构建此载体上后,得到的载体pCAMBIA1301-smRSGFP在大肠杆菌DH5α和农杆菌LBA4404,玉米骨干亲本昌7-2,群体自交系YQ7-96中都能表达出绿色荧光；(2)抗除草剂基因bar导入载体pCAMBIA 1301-smRSGFP后得到的载体pCAMBIA1301-smRSGFP-bar转到农杆菌中侵染玉米昌7-2,YQ7-96,用潮霉素和除草剂共筛选玉米得到了存活植株,表明此载体中的bar和抗潮霉素基因都能在玉米中表达；(3)载体pCAMBIA1301-smRSGFP-bar继续添加功能基因sHsp到载体上,通过玉米昌7-2,YQ7-96的热胁迫和GUS染色筛选表明,此载体上的这两个基因也能顺利表达。此载体的成功构建为多种基因的筛选检测提供多标记载体,使筛选检测具有简便性和广泛适用性。多选择性标记不仅可以降低植物遗传转化假阳性的几率,还可以根据具体实验条件和需求筛选检测,从而有效降低筛选成本和节省筛选时间。同时,此载体不仅可以在不破坏载体本身特性的前提下,利用导入的bar基因下游CaMV35S启动子连接检测目的基因,还能进行同一个启动子下目的基因和荧光基因的融合表达,同时针对各个标记基因的特点本着高效,简便,易行的原则采取的检测方法具有很强的独创性。含sHsp基因的载体构建成功,并进行检测后,不仅使得载体拥有的标记基因的检测效果得到验证,还验证了一个功能基因。该载体的以上优势都利于该载体在具体实践中广泛推广。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章 前言  12-26
  1.1 载体构建所涉及的标记基因  13-18
  1.2 载体构建所涉及的功能基因  18-22
  1.3 玉米转基因  22-24
  1.4 选择标记基因的联合筛选  24
  1.5 本研究的目的及意义  24-25
  1.6 本研究的技术路线  25-26
第二章 材料和方法  26-42
  2.1 本实验所用细菌菌株、培养基及相关溶液的种类与组成  26-29
  2.2 基因克隆分子操作方法  29-37
  2.3 载体的构建及鉴定  37-42
第三章 结果与分析  42-54
  3.1 含SMRSGFP基因的载体构建  42-44
  3.2 含SMRSGFP基因的载体的表达检测  44-45
  3.3 含CAMV35S+BAR基因载体的构建  45-47
  3.4 含BAR-CAMV35S基因的载体在玉米中的检测  47-49
  3.5 含SHSP基因的载体的构建  49-52
  3.6 含SHSP基因的载体在玉米中的检测  52-54
第四章 讨论  54-59
  4.1 含SMRSGFP基因的载体(PCAMBIA1301-SMRSGFP)的构建  54
  4.2 含sMRSGFP基因载体在玉米中的检测  54-55
  4.3 含BAR-CAMV35S基因的载体(PCAMBIA1301-SMRSGFP-BAR)的构建  55-56
  4.4 含BAR-CAMV35S基因的载体在玉米中的检测  56
  4.5 含SHSP基因的载体(PCAMBIA1301-SMRSGFP-BAR-SHSP)的构建  56
  4.6 含SHSP基因的载体在玉米中的检测  56-57
  4.7 载体的应用  57-59
第五章 结论  59-60
参考文献  60-70
附录  70-75
  附录1 玉米总RNA提取所用溶液配方  70
  附录2 培养玉米培养基  70
  附录3 GUS染色方法  70-71
  附录4 PCR扩增参数  71-72
  附录5 DNA电泳方法  72
  附录6 各个基因测序结果的比对  72-75
致谢  75-76
攻读硕士学位期间发表的学术论文  76

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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