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葡萄白藜芦醇合酶基因克隆及甜菜质体高效表达载体构建

作　者: 梁乃国
导　师: 崔杰
学　校: 哈尔滨工业大学
专　业: 遗传学
关键词: 葡萄白藜芦醇合酶基因克隆甜菜质体表达载体构建
分类号: S566.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

白黎芦醇(Resveratrol,简称Res)是一种植物抗毒素,具有抗菌、抗氧化、抗血小板凝集、保护心血管、抗癌等多种保健作用及抗植物病害等作用。然而,在自然的条件下,Res在植物体内的含量非常低,用传统提取方法得到高纯度的Res非常困难,且成本较高。白藜芦醇合酶(Resveartrol synthase简称RS)是Res合成途径中起作用的关键酶,本研究通过分子生物学手段,克隆白藜芦醇合酶基因,并在原核生物中进行表达研究及对筛选出的高表达量基因构建了甜菜质体高效表达载体,以期表达高丰度的白藜芦醇。目前己取得了如下进展:利用改进的CTAB法对筛选的6份野生葡萄叶片提取了基因组DNA,采用悬挂延伸PCR法分别克隆得到5个白藜芦醇合酶基因CNRS1、CNRS2、CNRS4、CNRS5、CNRS6,基因全长1179~1183bp,具有起始密码子和终止密码子,为完整的阅读框架,编码389~392个氨基酸,与已知葡萄RS基因(FJ770470.1、AF274281.1)核苷酸序列的一致性分别为95%和98%;96%和98%;89%和91.3%;91%和95%;96%和97.5%。说明所克隆的片段是RS完整基因。利用分子生物学方法,将克隆的各基因分别构建原核表达载体pET-30a-CNRS,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经抗性筛选、IPTG诱导表达及SDS-PAGE电泳,结果均获得大小与基因编码蛋白的理论值相符的诱导产物,且表现出随诱导时间的延长,蛋白质表达量逐渐提高,在诱导4h后,表达量达到最高,其中CNRS2基因表达量相对最高。将筛选出的高效表达的CNRS2基因构建了甜菜质体高效表达载体pSARCNRS2,为今后进一步研究选育抗病性甜菜品种及作为生物反应器高效表达白藜芦醇奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
第1章绪论  10-19
  1.1 白藜芦醇的研究进展  10-11
    1.1.1 白藜芦醇的化学结构及存在  10-11
    1.1.2 Res 生物合成途径  11
  1.2 白藜芦醇合酶的研究进展  11-13
    1.2.1 RS 的酶学性质  12
    1.2.2 RS 的诱导  12-13
  1.3 白藜芦醇合酶基因的研究现状  13-16
    1.3.1 白藜芦醇合酶基因的诱导表达  14-15
    1.3.2 白藜芦醇合酶基因植物中转化的研究现状  15-16
  1.4 植物叶绿体基因工程研究进展  16-17
  1.5 甜菜基因工程研究现状  17
  1.6 课题研究的目的和意义  17-18
  1.7 主要研究内容  18
  1.8 研究技术路线  18-19
第2章实验材料和方法  19-30
  2.1 主要试剂及材料  19
    2.1.1 基本试剂及生产厂家  19
    2.1.2 酶制剂及其它试剂盒  19
    2.1.3 质粒和菌体  19
    2.1.4 植物材料  19
    2.1.5 引物合成与DNA 测序  19
  2.2 主要仪器及厂家  19-20
  2.3 溶液配方  20-21
    2.3.1 培养基  20
    2.3.2 质粒提取溶液  20
    2.3.3 大肠杆菌感受态细胞制备溶液  20
    2.3.4 抗生素  20
    2.3.5 植物总DNA 提取溶液  20-21
    2.3.6 SDS-PAGE 试剂  21
  2.4 实验方法  21-30
    2.4.1 葡萄基因组DNA 的提取  21-22
    2.4.2 PCR 引物的设计  22-23
    2.4.3 克隆载体pBM18-T/RS 的构建  23-27
    2.4.4 重组质粒pBM18-T/RS 序列测定及分析  27
    2.4.5 大肠杆菌表达系统的建立和鉴定  27-28
    2.4.6 重组大肠杆菌的诱导表达实验  28
    2.4.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白质  28-30
第3章葡萄白藜芦醇合酶基因克隆与序列分析  30-37
  3.1 各类型葡萄品种的筛选与基因组DNA 的提取  30
  3.2 白藜芦醇合酶基因的克隆与序列分析及同源性  30-35
    3.2.1 白藜芦醇合酶全长基因的克隆与序列分析  30-33
    3.2.2 白藜芦醇合酶全长基因序列一致性比较  33
    3.2.3 白藜芦醇合酶基因（编码区）的克隆与序列一致性分析  33-35
  3.3 讨论  35-36
    3.3.1 葡萄叶片基因组DNA 的提取  35
    3.3.2 白藜芦醇合酶基因的克隆  35-36
  3.4 本章小结  36-37
第4章葡萄白藜芦醇合酶基因原核表达  37-42
  4.1 葡萄白藜芦醇基因原核表达载体构建与鉴定  37-39
  4.2 CNRS 基因诱导表达与检测  39-40
  4.3 讨论  40-41
  4.4 本章小结  41-42
第5章甜菜质体高效表达载体构建  42-46
  5.1 中间载体构建与鉴定  42-43
  5.2 甜菜质体高效表达载体构建与鉴定  43-45
  5.3 讨论  45
  5.4 本章小结  45-46
结论  46
展望  46-47
参考文献  47-52
附录  52-56
攻读硕士学位期间发表的学术论文  56-58
致谢  58

葡萄白藜芦醇合酶基因克隆及甜菜质体高效表达载体构建

内容摘要

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