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乌鲁木齐地区马铃薯病毒和类病毒的分子鉴定及检测技术研究

作　者: 董代幸
导　师: 罗明；张祥林
学　校: 新疆农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 马铃薯病毒类病毒 RT-PCR反应实时荧光RT-PCR 检测试剂盒
分类号: S435.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

乌鲁木齐地区是新疆马铃薯种薯、商品薯的重要生产基地。当前马铃薯生产中病毒病发生普遍而严重,成为制约生产的主要障碍。优质脱毒种薯是马铃薯产业健康、高效发展的重要保障,而建立快速、灵敏、准确的马铃薯病毒检测技术是脱毒种薯生产的关键。本研究调查鉴定乌鲁木齐地区马铃薯病毒种类,研究建立重要病原病毒和类病毒的分子生物学检测技术,为马铃薯无病毒原种材料的筛选和培育,种薯调运的检疫检验,实施病毒病害有效的防治措施提供科学基础和技术保障。通过症状调查、电镜观察、RT-PCR扩增及其克隆、序列分析,明确了侵染乌鲁木齐地区马铃薯的主要病原病毒有PVX、PVY、PVA、PLRV,类病毒为PSTVd。其中PVY、PLRV的侵染率最高,其次为PVX、PVA, PSTVd的侵染率较低。同源性分析表明,PVY分离物中5个为PVYO株系,1个为PVYN株系；PSTVd乌鲁木齐分离物同美国Wisconsin弱系的同源性为98.4%,同法国X76844中间株系M (mild)的同源性98.8%。乌鲁木齐地区马铃薯主要病原病毒分离物核苷酸序列之间绝大多数高度同源,而与有些国内外其他地区分离物则存在较大差异。针对乌鲁木齐地区马铃薯的主要病原病毒PVX、PVY、PVA、PLRV,设计病毒外壳蛋白基因特异性引物对,建立了能够同步检测4种病毒一步法多重RT-PCR检测方法。该法对PVX、PVY、PVA、PLRV扩增出的靶带大小分别为732bp、422bp、132bp和336bp。病毒RNA最低检测限度为7.8pg/μL。对PVM、PVS、AMV、TMV及PSTVd的扩增为阴性。结果表明,该方法比两步法多重RT-PCR检测更加快速、简便、高效。本研究根据PVA和PVY分离物CP基因的保守序列,分别设计了两对特异性引物和两条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同步检测PVA和PVY的二重荧光定量PCR方法。检测敏感度达到0.51fg/μL,比常规RT-PCR高100倍以上。基于优化的一步法多重RT-PCR检测体系研制组装成试剂盒,并应用于各类样品检测。结果显示具有特异、灵敏、简便、高效、价廉等特点,适合脱毒苗和脱毒种薯生产单位做大量样品的检测。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
第1章绪论  8-22
  1.1 立题背景  8-9
  1.2 马铃薯病毒和类病毒病害及防治  9-14
  1.3 马铃薯病毒检测方法  14-20
  1.4 研究内容  20-21
  1.5 技术路线  21-22
第2章乌鲁木齐地区马铃薯病毒、类病毒的鉴定与序列分析  22-40
  2.1 材料与方法  22-24
  2.2 结果与分析  24-38
  2.3 讨论  38-40
第3章马铃薯病毒多重RT-PCR检测体系的建立和优化  40-51
  3.1 材料与方法  40-45
  3.2 结果与分析  45-49
  3.3 讨论  49-51
第4章二重TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立和优化  51-61
  4.1 材料与方法  51-53
  4.2 结果与分析  53-59
  4.3 讨论  59-61
第5章一步法多重RT-PCR检测试剂盒的组装  61-68
  5.1 材料与方法  61-62
  5.2 结果与分析  62-66
  5.3 讨论  66-68
第6章结论  68-70
参考文献  70-77
附录1 马铃薯病毒及类病毒病田间症状  77-78
附录2 马铃薯病毒粒体电镜观察照片  78-79
致谢  79-80
作者简介  80

乌鲁木齐地区马铃薯病毒和类病毒的分子鉴定及检测技术研究

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