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来源于柑橘和葡萄的类病毒的检测与序列分析

作　者: 舒静
导　师: 洪霓
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 柑橘葡萄类病毒检测序列分析群体结构
分类号: S432.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 42次
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内容摘要

类病毒是危害植物的一类重要病原物。在柑橘上,柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid, CEVd)和柑橘类病毒Ⅱ(Citrus viroidⅡ,CVd-Ⅱ,又名啤酒花矮化类病毒Hop stunt viroid, HSVd)可导致柑橘树体矮化、树势减弱和产量降低,这两种类病毒也可侵染葡萄,但有关其对葡萄生长的影响尚不明确。本研究对我国柑橘及葡萄上发生的类病毒进行了分子鉴定及分子变异特点的分析,以期为深入了解我国发生的果树类病毒种类,明确其分子特性提供有用的信息。本研究主要结果如下：1.采用RT-PCR方法对来自湖北秭归县、武汉市和江西赣州市等地的24份柑橘样品进行了CEVd、CVd-Ⅰ(CBLVd)、CVd-Ⅰ-LSS、CVd-Ⅱ(HSVd)、CVd-Ⅲ、CVd-Ⅳ和CVd-OS共7种类病毒的检测。检测结果显示我国柑橘上至少存在4种柑橘类病毒,包括CEVd、CVd-Ⅰ、CVd-Ⅱ和CVd-Ⅲ。其中感染CVd-Ⅱ、CEVd、CVd-Ⅰ和CVd-Ⅲ的样品分别有9个、7个,3个和5个,除2个样品为CVd-Ⅱ单独感染和1个样品为CEVd单独感染外,其它检测到感染类病毒的柑橘样品均为2种或2种以上类病毒复合侵染。2.对来自同一柑橘样品Hb-C1的CEVd、CVd-Ⅰ、CVd-Ⅱ和CVd-Ⅲ的全长基因组RNA进行了克隆,每种类病毒随机选取20个克隆进行了测序和群体结构分析。结果表明,CEVd、CVd-Ⅰ、CVd-Ⅱ和CVd-Ⅲ均存在一定的分子变异,为多个分子变种组成的准种。在同一个分离物内的各分子变种相似性都在90%以上。其中,CVd-Ⅰ的变异程度最小,各分子变种间的相似性为96.3%-100%,优势分子变种占20%,两个亚优势变种的比例约占10%,非优势分子变种为60%；CVd-Ⅱ各分子变种间的相似性为95.1%-100%,优势分子变种占35%,亚优势变种的比例占15%,非优势分子变种占50%；CEVd各分子变种间的相似性为92.6%-100%,有一个优势分子变种,占15%,两个亚优势变种,比例各约占10%,非优势分子变种为65%；CVd-Ⅲ的变异程度较大,各分子变种间的相似性为92.4%-100%,有两个主要的优势分子变种,各占15%。3.采用RT-PCR方法对来自郑州和湖北的40份葡萄样品进行了CEVd和HSVd的检测,检测结果显示,有2份样品感染有CEVd,这是中国首次在葡萄上发现CEVd;有35%的葡萄样品感染有HSVd。将获得的CEVd扩增产物进行了克隆,每个分离物随机挑选10个克隆进行测序和群体结构分析。结果表明,各分子变种间核苷酸序列相似性为98.1%-100%,其中优势分子变种占20%,优势分子变种序列和共有序列完全一致。该来源葡萄的CEVd序列与NCBI登录的来源葡萄的CEVd序列相似性为93.8%,与来源柑橘的CEVd相似性最高,为99.0%,与紫背天葵、蚕豆和番茄来源的CEVd序列相似性分别为96.6%,95.5%和90.9%。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
1 文献综述  10-19
  1.1 类病毒概述  10-15
    1.1.1 类病毒的分类、结构和复制  10-13
    1.1.2 类病毒的检测  13-15
  1.2 柑橘类病毒研究进展  15-17
    1.2.1 柑橘裂皮类病毒  15-16
    1.2.2 柑橘类病毒Ⅱ  16
    1.2.3 其它几种柑橘类病毒  16-17
    1.2.4 柑橘类病毒的应用  17
  1.3 相关葡萄类病毒研究进展  17-19
    1.3.1 啤酒花矮化类病毒  17-18
    1.3.2 柑橘裂皮类病毒  18-19
2 材料与方法  19-27
  2.1 供试材料  19-20
  2.2 引物的设计与合成  20-22
  2.3 RNA提取  22
  2.4 RT-PCR扩增  22-23
  2.5 目标片段的回收与纯化  23
  2.6 目标片段与载体的连接  23-24
  2.7 连接产物转化宿主菌  24
    2.7.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备  24
    2.7.2 热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞  24
  2.8 PCR法筛选阳性克隆  24-25
  2.9 质粒DNA的制备  25-26
  2.10 重组质粒的PCR鉴定  26
  2.11 序列测定及分析  26-27
3 结果与分析  27-41
  3.1 柑橘类病毒RT-PCR检测结果  27-28
  3.2 柑橘类病毒扩增产物的克隆测序及序列分析  28-31
    3.2.1 CEVd的序列分析  28-30
    3.2.2 CVd-Ⅱ的序列分析  30-31
    3.2.3 CVd-Ⅲ序列分析  31
  3.3 葡萄类病毒RT-PCR检测结果  31-33
  3.4 葡萄类病毒扩增产物的克隆测序及序列分析  33-37
    3.4.1 CEVd的序列分析  33-34
    3.4.2 HSVd的序列分析  34-37
  3.5 4种柑橘类病毒的群体结构与遗传变异分析  37-41
    3.5.1 CEVd群体结构与遗传变异分析  37-38
    3.5.2 CVd-Ⅰ群体结构与遗传变异分析  38
    3.5.3 CVd-Ⅱ群体结构与遗传变异分析  38
    3.5.4 CVd-Ⅲ群体结构与遗传变异分析  38-41
4 讨论  41-43
参考文献  43-48
附录:主要试剂及溶液的配制  48-50
致谢  50

来源于柑橘和葡萄的类病毒的检测与序列分析

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