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大肠杆菌和沙门氏菌定量检测方法的建立和试剂盒的研制

作　者: 董丽宁
导　师: 曹慧
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 病原微生物 大肠杆菌 沙门氏菌 定量检测 试剂盒
分类号: S154.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


土壤是人类赖以生存和发展的基础,承担着来自环境中大约90%的污染物,目前人们对土壤质量的要求主要集中于农药残留,重金属污染和有机污染,对于土壤中病原微生物的研究关注不多。土壤中的病原微生物可以通过多种暴露途径与人体接触,从而危害人体健康。大肠杆菌和沙门氏菌是土壤中两类重要的病原微生物,但目前国内检测病原微生物主要采用传统的平板培养方法,其操作耗时耗力,往往需要5-6天才能完成,而且灵敏度比较低,假阳性数量较多。近几年,随着免疫学和分子生物学的发展,基于新技术的病原微生物检测方法也被建立起来,尤其是国外,已有部分快速检测试剂盒产品问世,而国内相关研究相对滞后。为建立一种有效的病原微生物定量检测方法,本研究采用MPN-PCR的方法来定量检测土壤中的病原微生物。该方法的关键思路在于利用了PCR方法快速准确的优势,取代了传统MPN方法中阳性结果的生化鉴定和血清学鉴定等步骤,从而减少了传统方法中的繁琐步骤,提高了检测效率。针对大肠杆菌和沙门氏菌的特异性基因分别设计了两对特异性引物,优化了PCR反应模板的制备,建立了一种定量检测病原微生物的方法,并对该方法的灵敏度进行了评估,最后,在该方法的基础上开发了定量检测试剂盒。最终结果如下：1、分别以大肠杆菌和沙门氏菌作为研究对象,对同一样品进行了MPN计数与平板菌落计数并对计数结果进行回归分析,建立了两者对数值之间的定量关系。大肠杆菌MPN计数与平板菌落计数回归方程为y=0.9566x, R2=0.994 1；沙门氏菌MPN计数与平板菌落计数回归方程为y=1.0144x,R2=0.9957。对两者回归系数进行方差分析显示极显著。使MPN计数法具有与平板菌落计数法一样的准确性,从而为病原微生物,甚至功能微生物的定量计数提供更为准确的结果。2、根据沙门氏菌的invA基因序列,采用沙门氏菌用的特异性引物invA-1和invA-2,引物扩增片段为284bp；根据大肠杆菌phoA基因序列,采用引物设计软件Primer 5.0进行设计引物,引物扩增片段为684bp。同时对三种PCR反应模板制备方法进行了比较,选用热裂解法作为PCR反应模板制备方法。利用灭菌土壤中添加纯菌实验评估了定量检测方法的灵敏度：大肠杆菌定量检测方法的灵敏度为25个/g土壤,沙门氏菌定量检测方法的灵敏度为250个/g土壤。3、在建立定量检测方法的基础上,成功研制MPN-PCR定量检测试剂盒,并对其进行了灵敏度和保存期的评估：大肠杆菌定量检测方法的灵敏度为25个/g土壤,沙门氏菌定量检测方法的灵敏度为250个/g土壤。有效期均为3个月。4、利用所开发的定量检测试剂盒,对张家港和北京的共13个土壤样品进行了大肠杆菌和沙门氏菌的定量检测,结果发现土壤中不存在沙门氏菌,有6个样品检测到大肠杆菌,数量分别为：350、500、950、700、800、1700个/g土壤。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10符号与缩略语说明  10-11前言  11-13综述  13-31  一、土壤中病原微生物的来源  13-15    1、禽畜粪便  13-14    2、污水灌溉  14-15  二、本研究所涉及的病原菌简介  15-19    1、大肠杆菌  15-17    2、沙门氏菌  17-19  三、病原微生物检测方法研究进展  19-26    1、传统的检测方法  19-20    2、免疫学上的方法  20-21    3、分子生物学上的方法  21-24    4、联合检测方法  24-26  参考文献  26-31第一章 病原微生物定量检测方法的建立  31-47  1. 材料与方法  32-36    1.1 材料  32-33    1.2 MPN计数法与平板菌落计数法计数结果相关性研究  33    1.3 大肠杆菌和沙门氏菌定量检测方法的建立  33-35    1.4 该方法的评价  35-36  2. 结果与分析  36-44    2.1 大肠杆菌稀释涂布平板计数法和MPN计数法相关性实验结果  36-38    2.2 沙门氏菌稀释涂布平板计数法和MPN计数法相关性实验结果  38-39    2.3 PCR反应模板的制备  39-42    2.4 引物特异性检测  42-43    2.5 灵敏度和检测限检测  43-44  3、讨论  44-46  参考文献  46-47第二章 、病原微生物定量检测试剂盒的研制  47-55  1、材料与方法  47-49    1.1 试剂盒的组成  47    1.2 定量检测试剂盒使用说明  47-48    1.3 试剂盒灵敏度和保存期检验  48-49  2、结果与分析  49-51    2.1 试剂盒灵敏度和保存期检验  49-51  3、讨论  51-53  参考文献  53-55第三章 病原微生物定量检测试剂盒的应用  55-69  1. 材料与方法  55-59    1.1 样品的采集及相关信息  55-56    1.2 土壤理化性质的测定及微生物计数  56    1.3 PCR方法定性检测土壤中大肠杆菌  56-59    1.4 试剂盒法定量检测土壤中病原微生物  59  2. 结果与分析  59-66    2.1 理化性质的测定  59-60    2.2 细菌真菌放线菌的计数  60    2.3 土壤总DNA的提取与纯化究  60-61    2.4 大肠杆菌和沙门氏菌特异性引物扩增  61-62    2.5 PCR产物的纯化回收  62    2.6 扩增产物的TA克隆  62-63    2.7 克隆转化子的测序  63    2.8 实际土壤样品的MPN-PCR定量检测  63-66  3. 讨论  66-67  参考文献  67-69全文总结  69-71创新之处  71-73附录:文中所用的培养基和试剂配方  73-75致谢  75

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中图分类: > 农业科学 > 农业基础科学 > 土壤学 > 土壤生物学 > 土壤微生物学
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