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噬菌体展示技术生物淘选结缔组织生长因子表位的研究

作　者: 邢洪雷
导　师: 刘乃丰
学　校: 东南大学
专　业: 内科学
关键词: 结缔组织生长因子噬菌体展示技术生物淘选抗原表位疫苗
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

研究目的:制备结缔组织生长因子(CTGF)抗原;对本实验组制备的CTGF单克隆抗体的特异性进行检测;运用噬菌体展示技术筛选结缔组织生长因子的抗原表位。研究方法: 1、从人血管内皮细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA,设计特异性引物,通过PCR方法扩增CTGF-C区242-349位氨基酸基因,插入噬菌体包膜蛋白基因的上游,制备出CTGF融合蛋白;2、采用体外人肾系膜细胞珠培养方法,用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM干预2天后提取结缔组织生长因子(CTGF)蛋白,用Western blot方法对本实验组制备的CTGF单克隆抗体特异性及CTGF融合蛋白进行定性检测;3、以CTGF单克隆抗体为筛选工具,对噬菌体随机12肽库进行筛选,逐步增加选择压力,经过三轮筛选后随机挑取4个阳性克隆测序,用竞争抑制和间接ELISA方法检测噬菌体阳性克隆的特异性。结果: 1、成功克隆CTGF-C区基因,插入表达载体,经IPTG诱导后获得分子量为30 ku的融合蛋白,免疫学检测证实为CTGF蛋白;2、Western blot实验结果证明:本实验组制备的CTGF单克隆抗体既可以与天然CTGF蛋白结合,也可以与重组CTGF蛋白结合;3、噬菌体文库经过三轮筛选后得到了阳性克隆。测序结果表明,随机挑取的4个阳性克隆的序列高度一致。推导获得12个氨基酸的小肽序列(GEPQTKLFSFPL),命名为ZD 521;竞争抑制和间接ELISA分析结果表明:CTGF单克隆抗体与阳性噬菌体的结合具有特异性。结论:本研究利用噬菌体展示技术成功获得了与CTGF单抗高度结合的小肽,从而为CTGF功能研究以及进一步以该肽为疫苗来预防和治疗纤维化疾病打下基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
主要缩略词表  7-8
前言  8-12
文献综述  12-18
正文  18-44
  材料和方法  19-34
    1. 试验材料  19-22
    2. 主要器材  22-23
    3. 实验方法  23-34
  实验结果  34-40
    1. CTGF 融合蛋白的制备及检测  34-36
    2. CTGF 单克隆抗体免疫活性和特异性鉴定  36-37
    3. 噬菌体展示技术筛选CTGF 表位  37-40
  讨论  40-44
参考文献  44-54
致谢  54-55
作者简介  55

噬菌体展示技术生物淘选结缔组织生长因子表位的研究

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