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HSV-2gD模拟抗原表位P6、HBsAg、IL18重组核酸疫苗的构建及免疫效果观察

作　者: 郑绮菡
导　师: 于爱莲；王玉
学　校: 泰山医学院
专　业: 病原生物学
关键词: 重叠PCR HSV-2gD模拟抗原表位 IL18 HBsAg 免疫效果
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的构建包含单纯疱疹病毒HSV-2gD模拟抗原表位P6、乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg(S)、白细胞介素18(IL18)三基因的真核表达重组克隆,并从中筛选出优势组合及观察优势组合的动物免疫效果,为开发多抗原核酸疫苗提供新的理论和实践资料。方法1.重组质粒pc-IL18-S、pc-S的构建将含有Xhol I和EcoR I酶切位点的IL18片段亚克隆入pcDNA3.1(-)中,经鉴定正确后,再用EcoR I和BamH I同时酶切pc-IL18和sT-S,并将酶切片段S回收后亚克隆入酶切回收后的pc-IL18质粒中,构建重组质粒pc-IL18-S。将含有EcoR V和BamHI酶切位点的S片段亚克隆入pcDNA3.1(-)中,构建真核表达质粒pc-S。pc-IL18-S质粒和pc-S质粒均为阳性对照组。2.含有重叠区S片段的扩增以测序正确的S基因为模板,以含有另一模板部分序列的上下游引物为引物,采用简并引物PCR方法扩增含有重叠区的S片段。3.重组质粒pc-IL18-P6-S、pc-IL18-NP6-S、pc-S-P6-IL18、pc-S-NP6-IL18的构建以前期获得的融合片段IL18-P6、IL18-NP6、P6-IL18和NP6-IL18[1]为第一模板,以含有重叠区的S基因为第二模板,采用重叠PCR方法扩增IL18-P6-S、IL18-NP6-S、S-P6-IL18、S-NP6-IL18三基因融合片段。鉴定正确后,将其插入pcDNA3.1(-)中,构建真核表达质粒pc-IL18-P6-S、pc-IL18-NP6-S、pc-S-P6-IL18、pc-S-NP6-IL18。4.间接免疫荧光筛选优势质粒及Western blot验证靶抗原的表达重组质粒pc-IL18-P6-S、pc-IL18-NP6-S、pc-S-P6-IL18、pc-S-NP6-IL18、pc-IL18-S、pc-S经阳性脂质体介导转染CHO细胞,并进行多次间接免疫荧光(IFA)检测。根据检测结果筛选出优势质粒。Western blot验证筛选出的优势质粒中S抗原和P6或NP6抗原的表达。5.优势质粒免疫BALB/c小鼠并观察免疫效果优势质粒pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18经扩增、纯化后分别待免疫4-6周龄的雌性BALB/c小鼠,并增设pcDNA3.1阴性对照组和生理盐水NS空白对照组。其中,首次免疫前三天(d)用普鲁卡因在质粒待免疫处进行预处理。在第0d、14d、30d于小鼠双下肢股四头肌处注射重组质粒50ug/只,且首次免疫辅加弗氏完全佐剂(质粒:弗氏佐剂=1:1),阴性对照组加弗氏完全佐剂而空白对照组不加。在首次免疫后第20d、45d、60d分别对小鼠进行尾动脉采血。ELISA法检测各组免疫小鼠血清中抗-S水平和抗-P6或抗-NP6水平。末次加强免疫后四周脱臼处死小鼠,并无菌取脾分离淋巴细胞,经计数后于96孔板培养,48小时后MTT法检测淋巴细胞增殖情况。结果⒈重组质粒的构建及筛选:①利用重叠PCR方法成功获得IL18-P6-S、IL18-NP6-S、S-P6-IL18、S-NP6-IL18三基因融合片段;利用酶切连接方法得到IL18-S片段。②通过不同的限制性内切酶酶切及连接,获得重组质粒pc-IL18-P6-S、pc-IL18-NP6-S、pc-S-P6-IL18、pc-S-NP6-IL18、pc-IL18-S、pc-S。③通过多次间接免疫荧光实验,证实各重组质粒所携带的HBsAg基因、P6或NP6基因在真核细胞中均可成功表达,且所要筛选的重组质粒pc-IL18-P6-S、pc-IL18-NP6-S、pc-S-P6-IL18、pc-S-NP6-IL18,其荧光亮度位于pcDNA3.1阴性质粒组和pc-IL18-S、pc-S阳性质粒组之间。其中,pc-S-P6-IL18、pc-S-NP6-IL18组与pc-IL18-P6-S、pc-IL18-NP6-S组相比较,无论是S抗原还是P6或NP6抗原,前两组的荧光亮度均明显强于后两组,且pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18比较组间没有显著差异,故认为所构建的四种重组质粒中pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18在真核细胞中的表达情况优于pc-IL18-P6-S和pc-IL18-NP6-S,选择pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18为优势质粒。④Western blot实验结果显示,优势质粒pc-S-P6-IL18和pc-S-NP6-IL18在CHO细胞中表达的S抗原可以检测到,但表位抗原P6和NP6并未检测到。2.优势质粒对小鼠的免疫效果观察:①ELISA法检测各组免疫小鼠抗-S水平。结果显示,pc-S-P6-IL18组(0.10)同pcDNA3.1组(0.04)比较,有显著性差异,P=0.000<0.05;pc-S-NP6-IL18组(0.09)同pcDNA3.1组(0.04)比较,有显著性差异,P=0.000<0.05;pc-S-P6-IL18组(0.10)同pc-S-NP6-IL18组(0.09)比较,差异不显著,P=0.167>0.05。②ELISA法检测各组免疫小鼠抗-P6或抗-NP6水平。结果显示,pc-S-P6-IL18组(0.09)同pcDNA3.1组(0.03)比较,有显著性差异,P=0.000<0.05;pc-S-NP6-IL18组(0.08)同pcDNA3.1组(0.03)比较,有显著性差异,P=0.001<0.05;pc-S-P6-IL18组(0.09)同pc-S-NP6-IL18组(0.08)比较,差异不显著,P=0.314>0.05。③MTT法检测脾细胞刺激指数SI。结果显示,pc-S-P6-IL18组(1.38)同pcDNA3.1组(0.92)比较,有显著性差异,P=0.000<0.05;pc-S-NP6-IL18组(1.35)同pcDNA3.1组(0.92)比较,有显著性差异,P=0.000<0.05;pc-S-P6-IL18组(1.38)同pc-S-NP6-IL18组(1.35)比较,差异不显著,P=0.210>0.05。结论1.重叠PCR法是体外获得多序列、短片段串联产物的有效方法。2.成功构建重组质粒pc-IL18-P6-S、pc-IL18-NP6-S、pc-S-P6-IL18、pc-S-NP6-IL18、pc-IL18-S、pc-S,并筛选出优势质粒pc-S-P6-IL18、pc-S-NP6-IL18。3.BALB/c小鼠接种重组质粒可有效提高其体液免疫应答和细胞免疫应答,且IL18有免疫佐剂功能,可提高靶抗原在机体中的免疫原性。质粒pc-S-P6-IL18组同pc-S-NP6-IL18组比较免疫效果相似,提示HSV-2gD模拟抗原表位12肽P6具备天然抗原表位12肽NP6的免疫原性,pc-S-P6-IL18可作为候选疫苗替代pc-S-NP6-IL18。4.携带多个外源基因的串联重组克隆具有良好的体内外表达活性;且串联基因的相对位置差异,会影响靶抗原的表达。本研究发现,IL18位于S抗原的羧基端其免疫效果优于位于S抗原的氨基端,这可为新型核酸疫苗的开发研究提供一点思路。

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中文摘要 4-7英文摘要 7-10符号说明 10-12前言 12-14第一部分 14-52 材料与方法 15-42 结果 42-45 讨论 45-48 小结 48-49 附图 49-52第二部分 52-69 材料与方法 53-61 结果 61-62 讨论 62-64 小结 64-65 附图 65-69第三部分 69-81 材料与方法 70-76 结果 76-78 讨论 78-80 小结 80-81结论 81-82附录 82-83下一步实验安排 83-84参考文献 84-86攻读硕士学位期间发表的论文 86-87致谢 87

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