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鸡传染性法氏囊病毒颗粒疫苗的研制及其免疫效果的研究

作　者: 王永伟
导　师: 杨倩；侯继波
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 传染性法氏囊病毒 鸡白介素15 颗粒疫苗 杆状病毒表达系统 免疫原性
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病毒引起的高度接触性传染病,主要感染青年鸡。传染性法氏囊病毒(IBDV)属于禽双RNA病毒科双RNA病毒属,无囊膜,呈二十面体对称,含有双节段的RNA。A片段编码VP2,VP4,VP3蛋白,B片段编码VP1蛋白,一种RNA依赖RNA的聚合酶。VP2蛋白表面含有两个抗原表位,被认为是主要的宿主保护性抗原。3-6周龄的鸡对该病毒高度易感。IBDV导致淋巴组织衰竭,最终损坏法氏囊组织,目前以VP2蛋白为抗原的基因工程疫苗是研究的热点。本实验主要从下面四个方面展开研究。1 IBDV VP2基因的克隆与序列分析取鸡场发病鸡的法氏囊组织,剖检观察有明显的病理变化。实验室研磨病料制成病毒悬液,通过琼脂扩散实验检测有比较高的抗原效价。用RT-PCR方法扩增出IBDV VP2基因,序列分析,VP2基因的大小为1452bp,编码484个氨基酸,七肽区序均为SWSASGS,在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、Q、I、D、A、I和S,具有IBDV强毒的分子特征。2鸡IL-15基因的克隆与序列分析取正常鸡的外周血,分离淋巴细胞。ConA刺激后提取淋巴细胞的总RNA,同样用RT-PCR的方法扩增出鸡IL-15基因。序列分析,IL-15基因的大小为579bp,编码193个氨基酸。与已发表的IL-15基因序列比对,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在98.6%-100%、99.4%-100%。3 IBDV VP2与鸡IL-15基因在昆虫细胞中的表达和鉴定将从发病鸡法氏囊组织中提取的VP2基因定向克隆到杆状病毒表达载体的供体质粒pFastBacDaul中的PH克隆位点,构建重组质粒pFastBacDaul-VP2。用同样的方法将从鸡外周血淋巴细胞提取的IL-15基因定向科隆到pFastBacDaul和pFastBacDaul-VP2的P10克隆位点,构建了重组质粒pFastBacDaul-IL15与pFastBacDaul-VP2-IL15。重组质粒再转化DH10Bac大肠杆菌,在DH10Bac大肠杆菌中,重组质粒与基因组Bacmid发生同源重组,从而获得重组穿梭载体Bacmid-VP2、Bacmid-IL15和Bacmid-VP2-IL15。用重组穿梭载体转染sf9细胞获得可表达目的蛋白的重组杆状病毒。用免疫印迹(Western-blotting)分析,在47 kDa处出现一条特异蛋白条带。倒置荧光显微镜可观察到重组杆状病毒表达蛋白所激发的荧光。4重组蛋白免疫原性研究本试验分别以杆状病毒表达系统在sf9细胞中表达的IBDV VP2蛋白和IBDV VP2与IL-15融合蛋白为抗原,制备油乳剂疫苗。免疫14日龄的非免鸡,研究IBDV VP2蛋白的免疫原性和IL-15对其影响,同时设立野生型杆状病毒对照组和空白对照组。并且购买商品化IBDV灭活苗以IL-15为免疫佐剂来研究IL-15的佐剂效应。通过间接ELISA测定抗体效价、和攻毒试验测定保护力。结果表明,表达的VP2蛋白具有较好的免疫原性,能诱导免疫鸡产生特异性中和抗体,并提供免疫保护。IL-15能维持中和性抗体保持较长的时间。

全文目录


中文摘要  6-8英文摘要  8-10英文缩略词  10-11引言  11-12第一部分 文献综述  12-32  第一章 传染性法氏囊病毒及其研究进展  12-24    1 IBDV的病原学特性  12-13    2 IBDV的分子生物学特性  13-15    3 IBD的防控  15-17    4 IBDV亚单位疫苗的研究  17-21    参考文献  21-24  第二章 细胞因子作为免疫增强剂的研究进展  24-32    1 细胞因子的特性和分类  24-25    2 不同细胞因子的生物活性  25-26    3 细胞因子免疫佐剂效应研究  26-28    4 细胞因子免疫佐剂的应用途径  28    5 细胞因子作为佐剂的应用前景  28-30    参考文献  30-32第二部分 试验研究  32-64  第三章 IBDV VP2和鸡IL-15基因的克隆与序列分析  32-42    摘要  32-33    1 材料与方法  33-37    2 结果  37-40    3 讨论  40-41    参考文献  41-42  第四章 IBDV VP2基因和鸡IL-15基因在昆虫细胞中的表达与鉴定  42-58    摘要  42-43    1 材料与方法  43-48    2 结果  48-55    3 讨论  55-56    参考文献  56-58  第五章 免疫原性研究  58-64    摘要  58-59    1 材料与方法  59-60    2 结果  60-62    3 讨论  62-63    参考文献  63-64全文总结  64-66致谢  66

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鸡
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