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过表达结核分枝杆菌HspX蛋白的重组卡介苗的保护效应

作　者: 陈玲霞
导　师: 范雄林
学　校: 华中科技大学
专　业: 病原生物学
关键词: 重组卡介苗 结核病 潜伏抗原 疫苗 HspX
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


背景与目的Ag85B蛋白是结核分枝杆菌(M. tb)对数生长期分泌的保护性抗原,过表达Ag85B的重组卡介苗(rBCG)可以诱导比卡介苗(BCG)更强的抗M. tb保护效应,并已在国外完成I期临床试验。HspX蛋白是M. tb在体外稳定期或体内休眠状态表达的优势蛋白;在氧耗尽或感染巨噬细胞后,BCG只表达微量的HspX。HspX蛋白能诱导M. tb感染者机体产生强烈的Th1型免疫应答。BCG免疫后,可以诱导机体产生针对M. tb对数生长期分泌的保护性抗原的Th1应答,但不会引起针对HspX特异性的IFN-γ免疫反应。尚不清楚HspX蛋白能否用于研制rBCG。我们鉴定了过表达HspX蛋白的rBCG菌株(rBCG::X)、过表达Ag85B蛋白的rBCG菌株(rBCG::85B)和含有空载体pMV261的rBCG菌株(rBCG::261)等三个重组疫苗,将这些疫苗免疫小鼠,评价了它们的免疫原性和免疫保护性。方法1.在NCBI网站用BLASTn分析方法对M. tb的hspX基因序列进行生物信息学分析;2. IPTG诱导重组蛋白Ag85B和HspX的原核表达,并进行纯化和鉴定,纯化蛋白用于疫苗的免疫原性分析;3.对rBCG::X、rBCG::85B和rBCG::261进行传代培养,利用Western blotting鉴定这三个重组菌株的培养上清和菌体裂解液,分析Ag85B和HspX蛋白表达情况和稳定性;4.将rBCG::X、rBCG::85B和rBCG::261分别免疫C57BL/6小鼠,免疫后6周和24周,分别用ELISA检测小鼠抗原特异性IgG抗体和用ELISPOT检测脾淋巴细胞分泌抗原特异性IFN-γ水平;5.将rBCG::X、rBCG::85B和rBCG::261分别免疫BALB/c和C57BL/6小鼠,小鼠免疫6周后,进行M. tb H37Rv毒株攻击感染,感染4周后,分别检测小鼠脾脏和肺脏的荷菌量以及肺脏病理改变,比较评价重组疫苗对不同种属小鼠的保护性。攻击感染18周后,分别检测C57BL/6小鼠脾脏和肺脏的荷菌量以及肺脏病理改变,比较评价重组疫苗对C57BL/6小鼠的短期和长期保护性。结果1. hspX基因生物信息学分析显示,与M. tb H37Rv菌株的hspX基因核苷酸序列一致性达100%的有7株细菌,均属于M. tb复合体和BCG,包括一株MDR-TB菌株;2.重组蛋白HspX和Ag85B原核表达纯化过程的SDS-PAGE和纯化蛋白的Western blotting,证实纯化蛋白具有较高的纯度和蛋白活性;3.重组疫苗的培养上清和菌体裂解液的Western blotting显示,rBCG::X在菌体裂解液中表达较高水平的HspX,培养上清中则有较高水平的Ag85B,且表达是稳定的;4. rBCG免疫C57BL/6小鼠后,能够诱导产生抗原特异性的体液和细胞免疫应答。血清IgG抗体ELISA检测显示,与rBCG::261免疫小鼠比较,rBCG::X免疫小鼠产生较高水平的HspX和Ag85B抗原特异性IgG抗体(p < 0.05)。IFN-γELISPOT检测显示,rBCG::X实验组在免疫后6周和24周,HspX和Ag85B蛋白特异性的分泌IFN-γ的细胞数比rBCG::261实验组高(p < 0.05);5.在攻击感染后4周和18周的荷菌量分析显示,与rBCG::261免疫小鼠相比,rBCG::X免疫小鼠在抵抗M. tb感染时产生更加持久的保护效应,肺脏的荷菌量更少(p <0.05),病理变化更轻微。比较rBCG::X和rBCG::85B疫苗的保护效应,rBCG::X免疫小鼠肺脏的荷菌量有轻度显著下降(p <0.05)。结论1. rBCG::X引起更高更持久的保护性可能与以下原因有关:过表达HspX蛋白可能使rBCG::X形成更厚的细胞壁,在体内持留时间延长;过表达的HspX和Ag85B,使这两个抗原特异性IFN-γ显著增加,从而使rBCG::X保护性显著增强;2.我们的结果证实,HspX蛋白作为BCG免疫人群和潜伏感染(LTBI)人群诱导差异免疫反应的抗原,发展rBCG可以提高BCG的保护性。表明在抗结核病(TB)的疫苗研究中,这些差异免疫反应抗原如M. tb潜伏感染抗原具有良好的应用前景。

全文目录


英文缩写词表  6-8
中文摘要  8-11
Abstract  11-14
前言  14-15
材料和方法  15-33
  一 实验材料  15-23
  二 实验方法  23-33
    (一) hspX 基因的生物信息学分析  24
    (二) 重组蛋白 HspX 和 Ag85B 的纯化、鉴定和定量  24-27
    (三) rBCG::X、rBCG::85B 和 rBCG::261 的培养和鉴定  27-28
    (四) 动物分组和免疫学评价  28-32
    (五) 统计学分析  32-33
结果  33-43
  一、hspX 基因的生物信息学分析结果  33
  二、重组蛋白 HspX 和 Ag85B 的纯化与鉴定  33-35
  三、rBCG::X 稳定且高表达 HspX 和 Ag85B 蛋白  35
  四、rBCG::X 诱导的抗原特异性抗体反应  35-37
  五、ELISPOT 分析 rBCG::X 免疫小鼠的 IFN-γ 水平  37-38
  六、rBCG::X 的保护效应分析  38-40
  七、肺脏病理学检查和评分  40-43
讨论  43-46
References  46-51
综述  51-63
  References  57-63
附录  63-64
致谢  64

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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