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猪链球菌2型与猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程亚单位疫苗的研究

作　者: 徐国华
导　师: 姚火春
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪链球菌2型 猪胸膜肺炎放线杆菌 溶菌酶释放蛋白 猪溶血素 ApxIA 串联表达 基因工程亚单位疫苗
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2, SS2)和猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae, APP)是两种重要的猪传染病的病原,具高发性和高传染性,在世界范围内给养猪业带来巨大的损失。前者还可以引起人患病甚至死亡,具有很重要的公共卫生意义,是一种重要的人兽共患病病原；而后者血清型复杂,国内以1、2、3、7血清型流行为主,防控难度较大。研究表明SS2和APP存在众多的毒力相关因子,而有些毒力因子可以使实验动物对这两种致病菌产生一定的免疫保护作用,因此可作为亚单位疫苗的候选蛋白。以猪链球菌2型HA9801株和猪胸膜肺炎放线杆菌S259株基因组DNA为模板,分别扩增溶菌酶释放蛋白(Muramidase Released Protein, MRP)、猪溶素(Suilysin, SLY)和胸膜肺炎放线杆菌外毒素I蛋白A(actinbacillus pleuropneumoniae toxin IA,ApxIA)抗原性较好的基因片段,再定向克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒mrp-pET28a、sly-pET28a和ApxIA-pET28a,经过酶切和测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出分子量分别为23kDa、26 kDa和40 kDa的融合蛋白。免疫转印结果显示三种融合蛋白都可以很好地被相应的康复血清所识别。用融合蛋白混合ISA-206佐剂制成疫苗免疫小鼠,ELISA测定抗体动态效价显示三种蛋白均能够使小鼠产生很好的特异性抗体(效价最高达1：204800),并且维持高浓度效价(1：12800以上)时间达10周以上。用MRP和SLY蛋白混合起来制成疫苗免疫Balb/C系小鼠、用ApxIA蛋白免疫ICR系小鼠(50μg亚单位/只),经过三免之后,分别用10xLD5o(1.4×108CFU)的SS2 HA9801株和5xLD5o(4×107CFU)的APP1 S259株攻毒。免疫保护试验结果显示：经过MRP和SLY蛋白混合免疫的Balb/C小鼠对SS2的相对保护率为72%；而经过ApxIA蛋白免疫的ICR小鼠对APP的相对保护率为66.7%。在上述研究基础上,设计串联引物,用一段疏水性柔性多肽(GlyGly GlyGlySer)×2碱基序列作连接接头将mrp和ApxIA基因拼接起来,构建ApxIA-linker-mrp串联基因,克隆至pMD18-T Simple载体中,经酶切和测序分析显示插入的片段长度为1521bp,插入的顺序和方向完全正确。再将融合基因定向克隆至pET-28a(+)中,构建重组表达质粒ApxIA-mrp-pET28a,并转化至BL21中诱导表达。得到融合蛋白ApxIA-MRP,免疫转印结果表明其能很好的与两种菌的康复血清反应。用串联的融合蛋白混合ISA-206制成疫苗,三次免疫ICR系小鼠,期间测定抗体动态效价,其血清抗体效价可达1：102400,维持时间长达11周。用该疫苗免疫30日龄的断奶仔猪,共三次免疫,首免lmg/头、二免800μg/头、三免500μg/头；每次免疫结束后1周采集血清测定抗体效价,测定发现抗体效价分别为1：3200、1：51200、1：204800。三免后分别用10倍LD50的APP1S259株及SS2 HA9801株攻击,结果显示对这两种致病菌的保护率分别达80%和100%。证明串联融合蛋白可以对其同源株产生一定的保护率,为SS2和APP的基因工程亚单位串联苗的研制提供了依据。

全文目录


摘要  10-12ABSTRACT  12-14第一篇 文献综述  14-42  第一章 猪链球菌2型的研究进展  14-30    1 病原学  14    2 流行病学  14-15    3 临床症状和病理变化  15-16      3.1 临床症状  15-16      3.2 病理变化  16    4 猪链球菌2型的毒力(相关)因子  16-21      4.1 荚膜多糖(Capsular poLysaccharide,CPS)  16-17      4.2 溶菌酶释放蛋白(Muramidase Released Protein,MRP)与胞外因子(Extracellarprotein Factor, EF)  17-18      4.3 猪溶血素(Suilysin,SLY)  18      4.4 纤连蛋白结合蛋白(Fibronectin and Fibrinogen binding protein,FBPS)  18-19      4.5 谷氨酸脱氢酶(GDH)  19      4.6 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)  19-20      4.7 毒力相关序列orf2  20      4.8 其他的毒力因子  20-21    5 猪链球菌2型基因工程亚单位疫苗的研究进展  21-24      5.1 荚膜多糖(CPS)  21      5.2 溶菌酶释放蛋白MRP和细胞外因子EF  21-22      5.3 溶血素(SLY)  22-23      5.4 SS2其他亚单位疫苗研究  23-24    参考文献  24-30  第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌的研究进展  30-42    1 病原学  30    2 流行病学  30-31    3 临床症状和病理变化  31-32      3.1 临床症状  31      3.2 病理变化  31-32    4 猪胸膜肺炎放线杆菌的毒力(相关)因子  32-34      4.1 溶血毒素Apx(haemolysins)  32-33      4.2 荚膜多糖(Capsular Polysaccharide,CPS)  33      4.3 脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)  33-34      4.4 外膜蛋白(Outer Membrane Proteins,OMP)  34      4.5 转铁结合蛋白(Transferrin Binding Proteins,Tbp)  34    5 猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程亚单位疫苗的研究进展  34-37      5.1 溶血毒素Apx(haemolysins)  35      5.2 转铁结合蛋白(Transferrin Binding Proteins,Tbp)  35-36      5.3 外膜蛋白(Outer Membrane Proteins,OMP)  36-37    参考文献  37-42第二篇 试验部分  42-96  第三章 猪链球菌2型MRP亚单位疫苗的研究  42-64    1 材料与方法  43-52      1.1 菌株与质粒  43      1.2 主要酶和试剂  43      1.3 主要仪器设备  43      1.4 实验动物  43-44      1.5 目的基因的PCR扩增与回收  44-45        1.5.1 引物设计与合成  44        1.5.2 PCR扩增体系与条件  44-45        1.5.3 PCR产物的胶回收  45      1.6 目的基因的A/T克隆  45-46        1.6.1 A/T连接反应体系  45        1.6.2 感受态细胞的制备  45-46        1.6.3 连接产物的转化  46        1.6.4 重组质粒的鉴定  46      1.7 重组质粒mrp-pET28a和sly-pET28a的构建  46-48        1.7.1 重组质粒mrp-pMD18T、sly-pMD18T和pET-28a(+)的双酶切  46-47        1.7.2 mrp、sly基因片段与质粒载体pET-28a(+)的连接  47        1.7.3 感受态细胞的制备(方法同上)  47-48        1.7.4 连接产物转化(方法同上)  48        1.7.5 原核表达载体mrp-pET28a和sly-pET28a的双酶切鉴定  48      1.8 重组蛋MRP和SLY亚单位的诱导表达  48-49        1.8.1 阳性质粒转化入表达菌BL21  48-49        1.8.2 时间梯度诱导表达  49      1.9 SDS-PAGE检测重组蛋白的表达  49        1.9.1 SDS-PAGE凝胶的制备  49        1.9.2 SDS-PAGE电泳  49        1.9.3 染色与脱色  49      1.10 重组蛋白的纯化  49-50        1.10.1 重组蛋白的大量诱导  49-50        1.10.2 包涵体的纯化  50      1.11 重组蛋白的Western blotting分析  50-51      1.12 重组蛋白的动物实验  51-52        1.12.1 疫苗制备  51        1.12.2 疫苗免疫Balb/C小鼠及免疫血清的收集  51        1.12.3 间接ELISA法测定重组蛋白亚单位疫苗免疫后的Balb/C小鼠体内的抗体动态效价  51-52        1.12.4 动物免疫保护试验  52    2 结果  52-58      2.1 mrp和sly基因的PCR  52-53      2.2 重组质粒的双酶切鉴定  53-54      2.3 测序  54      2.4 重组质粒mrp-pET28a和sly-pET28a在BL21中的表达  54-56      2.5 重组蛋白的纯化及western blotting分析结果  56-57      2.6 重组蛋MRP和SLY在Balb/C小鼠体内的抗体产生动态  57-58      2.7 免疫保护试验  58    3 讨论  58-60    参考文献  60-62    附录  62-64  第四章 猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIA亚单位疫苗的研究  64-78    1 材料  65-70      1.1 菌株与质粒  65      1.2 主要酶和试剂  65      1.3 主要仪器设备  65      1.4 试验动物  65      1.5 目的基因的PCR扩增与回收  65-66      1.6 目的基因的A/T克隆  66-67        1.6.1 A/T连接反应体系  66-67        1.6.2 感受态细胞的制备  67        1.6.3 连接产物的转化  67        1.6.4 重组质粒的鉴定  67      1.7 重组质粒ApxIA-pET28a的构建  67-69        1.7.1 重组质粒ApxIA-pMD18T和pET-28a(+)的双酶切  67-68        1.7.2 ApxIA片段与质粒载体pET-28a(+)的连接  68        1.7.3 感受态细胞的制备(方法同上)  68        1.7.4 连接产物转化(方法同上)  68        1.7.5 原核表达载体ApxIA-pET28a的双酶切鉴定  68-69      1.8 重组蛋白ApxIA亚单位的诱导表达  69        1.8.1 阳性质粒转化入表达菌BL21  69        1.8.2 时间梯度诱导表达  69      1.9 SDS-PAGE检测重组蛋白的表达  69      1.10 重组蛋白的纯化  69      1.11 重组蛋白的Western blotting分析  69      1.12 重组蛋白ApxIA的动物试验  69-70        1.12.1 疫苗制备  69        1.12.2 单位疫苗免疫ICR小鼠以及免疫血清的收集  69-70        1.12.3 间接ELISA法测定重组蛋白亚单位疫苗免疫后的ICR小鼠体内的抗体动态效价  70        1.12.4 动物免疫保护试验  70    2 结果  70-75      2.1 ApxIA基因的PCR  70-71      2.2 重组质粒的双酶切  71      2.3 测序  71-72      2.4 重组质粒ApxIA-pET28a在BL21中的表达  72-73      2.5 重组蛋白的纯化及western blotting分析  73      2.6 重组蛋白ApxIA在ICR小鼠体内的抗体产生动态  73-74      2.7 免疫保护试验  74-75    3 讨论  75-76    参考文献  76-77    附录  77-78  第五章 MRP和ApxIA亚单位的串联表达及其相关研究  78-96    1 材料  79-85      1.1 菌株与质粒  79      1.2 主要酶和试剂  79      1.3 主要仪器设备  79      1.4 试验动物  79      1.5 目的基因的PCR扩增与回收  79-82        1.5.1 引物设计与合成  79-80        1.5.2 串联PCR扩增方法  80-81        1.5.3 PCR产物的胶回收  81-82      1.6 ApxIA-linker-mrp基因的A/T克隆  82        1.6.1 A/T连接反应体系  82        1.6.2 感受态细胞的制备  82        1.6.3 连接产物的转化  82        1.6.4 重组质粒的鉴定  82      1.7 重组质粒ApxIA-mrp-pET28a的构建  82-83        1.7.1 重组质粒ApxIA-mrp-pMD18T和pET-28a(+)的双酶切  82-83        1.7.2 ApxIA-mrp片段与质粒载体pET-28a(+)的连接  83        1.7.3 连接产物转化(方法同上)  83        1.7.4 原核表达载体ApxIA-mrp-pET28a的双酶切鉴定  83      1.8 重组串联ApxIA-mrp蛋白亚单位的诱导表达  83-84        1.8.1 重组阳性质粒转入表达菌BL21  83-84        1.8.2 时间梯度诱导表达  84      1.9 SDS-PAGE检测重组串联蛋白ApxIA-MRP的表达  84      1.10 重组融合蛋白的纯化  84      1.11 重组串联蛋白ApxIA-MRP的Western blotting分析  84      1.12 重组串联蛋白ApxIA-MRP的动物实验  84-85        1.12.1 串联蛋白亚单位疫苗的制备  84        1.12.2 串联亚单位疫苗免疫ICR小鼠以及免疫血清的收集  84        1.12.3 间接ELISA法测定经ApxIA-MRP免疫的ICR小鼠体内的抗体动态效价  84-85        1.12.4 动物免疫保护试验  85    2 结果  85-92      2.1 串联基因ApxIA-mrp的PCR  85-86      2.2 重组质粒的双酶切  86-87      2.3 测序  87-88      2.4 重组质粒ApxIA-mrp-pET28a在BL21中的表达  88      2.5 重组串联蛋白的纯化及westenrblo廿ing分析  88-89      2.6 重组串联蛋白ApxIA-MRP在ICR小鼠及仔猪体内的抗体产生动态  89-90      2.7 免疫保护试验  90-92    3 讨论  92-94    参考文献  94-95    附录  95-96全文总结  96-98致谢  98

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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