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日本血吸虫DNA疫苗在小鼠体内的代谢及时空表规律研究

作　者: 刘海峰
导　师: 余龙江
学　校: 华中科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 日本血吸虫 DNA疫苗 Sj23 EGFP 生物分布性代谢规律 BALB/c小鼠
分类号: S855.91
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

血吸虫病是一种世界性的寄生虫传染性疾病,被列为世界十大恶性传染病之一,对人类及家畜的安全都具有极大的危害,是许多国家和地区政府都非常重视的公共安全问题。常规的预防和治疗手段难以遏制形势日益严峻的血吸虫疫情,疫苗作为一种良好的防治兼顾的措施,其研发具有重大的经济和社会价值。DNA疫苗是近20年才出现的疫苗概念,被誉为“第三代疫苗”,与常规的第一、二代疫苗相比具有显著的优势。至今已有近百种针对各种重大疾病的DNA疫苗处于实验室或临床研发阶段,其中已有四种兽用DNA疫苗被批准上市,但尚无DNA疫苗产品被批准用于人,概其原因主要是DNA疫苗的安全性评价体系尚缺乏规范的标准。本研究以日本血吸虫DNA疫苗为对象,旨在研究DNA疫苗在动物体内的分布和代谢规律。通过将绿色荧光蛋白EGFP基因和日本血吸虫抗原Sj23基因共同插入真核表达质粒pVIVO2中,构建了共表达和融合表达的DNA疫苗,应用PCR检测技术、荧光激发显色技术和酶联免疫吸附(ELISA)技术,分别在DNA水平,抗原水平和抗体水平上研究了DNA疫苗在动物体内的分布,表达及代谢规律,为血吸虫DNA疫苗的临床研究提供实验依据和数据支持。本研究初步取得了以下成果:(1)应用重组PCR技术成功构建了日本血吸虫23 KDa膜内在蛋白抗原Sj23基因和绿色荧光蛋白EGFP基因共表达的DNA疫苗pVIVO2-Sj23/EGFP和融合表达DNA疫苗pVIVO2-Sj23.EGFP,并进行了酶切和测序验证。(2)应用阳离子脂质体介导DNA疫苗转染人胚肾癌细胞系(HEK-293)进行体外表达验证,结果表明构建的DNA疫苗可以在真核细胞中正确表达。(3)采用高盐变性蛋白初步纯化和色谱柱串联精细纯化等方法纯化DNA疫苗,制备了医药级别的DNA疫苗产品。(4)肌肉注射DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,利用PCR技术检测DNA疫苗在小鼠体内的生物分布,荧光显微镜检测抗原蛋白的表达分布,ELISA检测DNA疫苗诱发抗体的强度和存留时间。结果表明,DNA疫苗质粒在免疫后迅速分布于全身组织与器官,在注射部位等组织可存留80天以上,抗原蛋白表达持续时间超过7天,DNA疫苗中抗原蛋白诱导的特异抗体可存留70天以上,说明DNA疫苗诱发产生的保护力足以达到保护宿主抵御血吸虫侵染的目的。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
1 绪论  10-21
  1.1 血吸虫病概述  10-11
  1.2 DNA 疫苗及其安全性研究进展  11-16
  1.3 日本血吸虫23 kDa 抗原（Sj23）研究进展  16-17
  1.4 绿色荧光蛋白的研究进展  17-19
  1.5 本文的研究目标和主要内容  19-21
2 日本血吸虫 DNA 疫苗 pVIVO2-Sj23/EGFP 和 pVIVO2-Sj23.EGFP 的构建  21-36
  2.1 材料与方法  21-31
  2.2 结果与讨论  31-35
  2.3 本章小结  35-36
3 DNA 疫苗质粒的规模精细纯化  36-45
  3.1 材料与方法  36-41
  3.2 结果与讨论  41-43
    3.2.1 实验结果  41-43
    3.2.2 讨论  43
  3.3 本章小结  43-45
4 DNA 疫苗的体外表达验证  45-51
  4.1 材料与方法  45-48
  4.2 结果与讨论  48-50
  4.3 本章小结  50-51
5 DNA 疫苗在小鼠体内的代谢及时空表达研究  51-64
  5.1 材料与方法  51-56
  5.2 DNA 疫苗在小鼠体内的分布性研究  56-59
  5.3 抗原蛋白在体内的表达与分布研究  59-61
  5.4 ELISA 检测Sj23 抗体在小鼠体内的存留时间  61-62
  5.5 讨论  62-63
  5.6 本章小结  63-64
6 总结与展望  64-67
  6.1 研究总结  64-65
  6.2 课题展望  65-67
致谢  67-69
参考文献  69-76
附录1 基因测序结果与载体图谱  76-83
附录2 攻读硕士学位期间发表的论文目录  83

日本血吸虫DNA疫苗在小鼠体内的代谢及时空表规律研究

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