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传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2基因在家蚕中的表达及亚单位疫苗的初步研究

作　者: 左松
导　师: 张许科
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: IBDV VP2蛋白亚单位疫苗免疫原性家蚕
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 3次
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内容摘要

传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病毒引起的一种急性高致病性传染病,是危害养禽业的主要传染病之一,该传染病以免疫抑制为特征,除造成直接损失外,还会造成鸡群对其他病原微生物的易感性增强和免疫失败,给养禽业带来更大的间接损失。自从上世纪80年代出现了变异株和超强毒株后,传统的灭活疫苗和弱毒疫苗已经面临着严峻的考验。我国养禽业日益扩大,而IBDV的流行情况也越来越复杂,且有效的IBDV疫苗非常少,因此迫切需要解决这一矛盾。家蚕养殖是我国的优势产业,用家蚕反应器表达IBDV VP2蛋白旨在将我国的优势产业与不断发展的分子生物学技术紧密结合起来,为开发高效广谱的IBDV亚单位疫苗打下基础。IBDV的主要结构蛋白VP2蛋白是最主要宿主保护性抗原,在VP2上的点突变是造成IBDV变异的主要原因。为研究VP2蛋白作为IBDV亚单位疫苗的抗原,本研究根据Genbank发表的IBDV基因序列,设计合成一对引物,利用RT-PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白VP2基因。将IBDV LYZS株的VP2蛋白基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBKblue中,将重组的载体pBK-IVP2与野生家蚕病毒的线性化DNA(Bom-Ex)共转染到家蚕培养细胞中,获得重组病毒vBmNPV-IVP2。用重组病毒感染家蚕5龄起幼虫或蚕蛹后,再利用琼脂扩散试验、SDS-PAGE和Westem blotting等方法检测蚕血淋巴中重组VP2蛋白的表达量以及免疫反应性。结果表明重组VP2蛋白具有免疫反应性,家蚕蚕蛹感染5天时在蚕血淋巴中的表达量最高。用感染后第5天的家蚕蚕蛹血淋巴作抗原加入本实验特制的免疫增强剂制备油佐剂疫苗,进行了该疫苗的安全性试验和免疫-攻毒试验。在安全性试验中,利用制备的亚单位疫苗对4周龄SPF鸡进行注射,每只鸡注射0.6ml,注射后逐日观察鸡的采食、饮水、精神状态等,连续观察14天,然后剖检,进行疫苗注射部位及内脏器官、肌肉、皮下等观察。观察结果显示,未出现任何副反应。在免疫-攻毒试验中,对非免疫雏鸡进行28日龄免疫,免疫后定期采血检测抗体。免疫21天后使用IBDV强毒(BC6/85株)攻击,攻毒96小时后扑杀并剖检。结果显示:各免疫组均得到很好的保护,保护率达到100%。实验表明重组IBDV VP2蛋白疫苗能有效地抵抗IBDV强毒(BC6/85株)的攻击,保护率高达到100%。结果表明,用含IBDV VP2蛋白的蚕血淋巴制备的疫苗安全好且有良好的免疫原性,为利用家蚕生物反应器开发IBDV新型亚单位疫苗奠定了基础。

全文目录

致谢 4-6摘要 6-71 文献综述 7-17 1.1 鸡传染性法氏囊病病毒研究进展 7-14 1.1.1 病原学 7-8 1.1.2 诊断 8-10 1.1.3 IBDV 的致病机理 10-11 1.1.4 IBDV 基因组结构 11-12 1.1.5 IBDV 基因编码的主要蛋白及其功能 12-13 1.1.6 IBDV 的免疫防制策略 13-14 1.2 BmNPV-家蚕表达系统简介 14-17 1.2.1 BmNPV-家蚕表达系统简介 14 1.2.2 BmNPV-家蚕表达系统概述 14-15 1.2.3 BmNPV-家蚕表达系统的优势与特点 15-172 引言 17-193 材料与方法 19-32 3.1 试验材料 19-22 3.2 试验方法 22-324 结果与分析 32-38 4.1 IBDV 基因组RNA 的提取与VP2 基因的扩增 32 4.2 IBDV VP2 基因克隆入pMD-18T 载体中并测序分析 32-33 4.3 构建重组转移载体pBK-IVP2 33 4.4 细胞转染及重组病毒的拯救 33-34 4.5 重组病毒的鉴定 34 4.6 重组病毒感染家蚕蚕蛹 34-35 4.7 重组蛋白的鉴定 35-36 4.8 亚单位疫苗的制备 36 4.9 动物试验 36-385 结论与讨论 38-39 5.1 结论 38 5.2 讨论 38-39参考文献 39-46ABSTRACT 46-48附录 48-49

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