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乙型脑炎病毒NS1蛋白的新型prime-boost免疫策略研究

作　者: 吴鹏
导　师: 陈溥言
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 乙型脑炎病毒非结构蛋白1 DNA疫苗亚单位疫苗 Prime-boost(初免-加强免疫)
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV),又称日本脑炎病毒。属于黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属,日本脑炎病毒广泛分布于亚洲南部和东南地区,其中包括中国、印度、日本等地。主要通过蚊子传播致使人发生急性脑炎,其致死率从20%到50%,并且绝大多数的幸存者都具有中枢神经系统的后遗症。猪流行性乙型脑炎与人流行性乙型脑炎密切相关。因此,预防猪感染本病是防止人患乙脑的重要措施。稳定、安全以及新型的乙脑疫苗已经成为近年乙脑感染防治的主要研究方向。近年来,随着分子生物学技术的飞速发展,乙型脑炎基因工程疫苗等多种新型的疫苗都在不断的研究开发中。疫苗在保护机体免受病毒感染中起到重要作用Prime-boost (DNA初免和蛋白加强)免疫的方法是通过DNA编码病毒目的蛋白进行首次免疫,再用此体外表达的蛋白进行加强免疫的策略。通过DNA初免和蛋白加强免疫的策略,我们对日本脑炎病毒NS1蛋白的效力进行了研究。本研究主要从以下几个方面展开。1.合成日本脑炎病毒NS1蛋白,在此基础上将其插入真核表达质粒pCDNA3.0中,构建重组真核质粒pcDNA-NS1。重组质粒转染BHK-21细胞,利用间接免疫荧光证明pcDNA-NS1在真核细胞内能有效的转录和表达；Western-blot检测表明重组真核质粒的表达产物能与JEV阳性血清特异性结合,证明其具有一定的生物学活性和抗原性。2.扩增NS1基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+),命名为pET-rNSl.将重组质粒转化大肠杆菌(E. coli) BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定的阳性菌经1mMIPTG诱导表达4h后,将大肠杆菌以6000 rpm离心10min,用PBS洗两次,收集细菌,将其悬浮在PBS中,进行超声波破碎,以10000 rpm离心20min,将上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析,结果表明这种蛋白以包涵体形式存在。将包涵体在8M的尿素中过夜溶解,然后将上清过柱对重组表达产物进行纯化。结果显示融合蛋白的分子量为40kDa, Western blot表明重组蛋白具有抗JEV的特异抗原性。3.利用新型的免疫策略,为了评价构建的DNA疫苗和重组蛋白疫苗的免疫效力,将4周龄Ba1b/c小鼠随机分成5组,设rNS1(Ⅰ), pcDNA-NS1(Ⅱ), pcDNA-NS1+rNS1(Ⅲ),弱毒疫苗(Ⅳ), pcDNA3.0空载体对照组(V)。肌肉注射免疫,重组质粒的免疫剂量为50μg/只,重组蛋白的免疫剂量为200 pmo1/只,弱毒苗免疫组按照使用说明进行。利用商品化的ELISA试剂盒检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4的能力,并与弱毒苗进行比较。同时进行攻毒保护性试验,利用微量中和试验检测免疫攻毒后的中和抗体。结果表明,新型的疫苗策略能诱导产生针对JEV的特异性体液免疫和细胞免疫应答。弱毒苗免疫组产生了最高的中和抗体,其次由高到低依次为,pcDNA-NS1+rNS1, rNSl, pcDNA-NS1.通过对抗体亚型及细胞因子的测定,rNSl主要是增强Th2免疫反应,pcDNA-NS1和弱毒苗免疫组增强Thl免疫反应,而pcDNA-NS1+ rNS1则产生Th1/Th2 (?)昆合型的免疫反应。pcDNA-NS1+rNS1免疫组具有较高的免疫保护作用。这为研究能够更好地预防JEV感染的新型疫苗提供新的思路。总之,新型prime-boost(DNA初免蛋白加强)免疫策略能有效提高抗体水平,以及T、B细胞的免疫反应,对乙型脑炎的感染能起到很好的免疫保护作用。

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摘要 6-8ABSTRACT 8-10第一篇文献综述 10-28 第一章乙型脑炎的研究进展 10-20 1 乙型脑炎发展历史及地理分布 10-11 2 乙型脑炎的流行病学特点 11 3 乙型脑炎生物学研究进展 11-16 4 乙型脑炎检测技术研究进展 16-18 5 总结 18-20 第二章 Prime/Boost免疫策略的研究进展 20-23 1 Prime/Boost免疫策略能够增强细胞免疫应答 20-21 2 Prime/Boost策略在小鼠模型上的研究 21 3 Prime/Boost策略提高细胞免疫应答的机制探讨 21-23 参考文献 23-28第二篇研究内容 28-70 第三章乙型脑炎病毒NS1蛋白基因真核质粒的构建 28-38 1 材料与方法 29-33 2 结果 33 3 讨论 33-37 参考文献 37-38 第四章乙型脑炎病毒NS1蛋白基因在大肠杆菌中的融合表达 38-54 1 材料 39 2 方法 39-47 3 结果 47-49 4 讨论 49-52 参考文献 52-54 第五章乙型脑炎病毒NS1蛋白的新型免疫策略的效力研究 54-70 1 材料和方法 55-58 2 结果 58-62 3 讨论 62-66 参考文献 66-70全文总结 70-72致谢 72

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