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日本血吸虫P14基因纳米微球-DNA疫苗的初步研究

作　者: 魏敏
导　师: 汪学龙
学　校: 安徽医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 血吸虫病核酸疫苗调宁蛋白纳米微球保护性免疫
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:pcDNA3.1(+)-SjP14真核表达载体的提取及鉴定,并利用重组质粒和纳米微球-DNA疫苗免疫小鼠,探讨其对小鼠血吸虫感染的保护作用和纳米微球的增强作用。方法:1. pcDNA3.1(+)-SjP14真核表达载体的提取和鉴定:从重组质粒菌株中提取质粒并进行双酶切鉴定,利用该重组质粒转染Cos-7细胞,RT-PCR和Western blotting检测其体外表达,以验证其能表达出重组蛋白。2. DNA疫苗的制备及保护作用研究:制备无内毒素DNA疫苗及纳米微球-DNA疫苗,用于免疫小鼠。将雌性BALB/c小鼠(6-8周龄,体重18-22g)随机分为3组,每组10只,分别为生理盐水对照组、pcDNA3.1(+)-SjP14组及纳米微球-DNA疫苗组。各组小鼠分别肌肉注射100μg/鼠/次,每2周免疫一次,共3次。末次免疫后2周,经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(30±1)条/鼠。尾蚴攻击6w后用颈椎脱臼法处死小鼠,收集成虫,计算减虫率;同时留取肝脏,部分消化后在显微镜下行虫卵计数,计算减卵率,部分肝脏用于组织病理学分析(HE染色法),观察肝细胞变化及肉芽肿情况。结果:本实验成功提取了pcDNA3.1(+)-SjP14重组质粒,进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片段;纯化上述质粒,转染至Hela细胞,经新霉素筛选得出阳性单克隆细胞株,扩大培养。RT-PCR和Western blotting结果显示,两种质粒转染至Hela细胞内均可表达。分别制备无内毒素pcDNA3.1(+)-SjP14和纳米微球-DNA疫苗。以该疫苗免疫BALB/c小鼠,结果表明:pcDNA3.1(+)-Sj P14p核酸疫苗能明显提高小鼠的抗血吸虫感染能力,减虫率和减卵率分别达到44.6%和61.6%;纳米微球-DNA疫苗免疫能进一步提高小鼠抗血吸虫感染作用,减虫率和减卵率分别提高至56.2%和73.5%。大体解剖可见,生理盐水组肝脏呈暗褐色,质硬,表面可见弥漫性粟粒样虫卵结节分布,结节隆起密集,体积较大。pcDNA3.1(+)-SjP14组小鼠肝脏色泽略带暗红色,质地较软,表面较光滑,隐约可见少量灰白色小点,虫卵结节较少;纳米微球-DNA疫苗组,肝脏颜色呈鲜红色,表面光滑,虫卵结节少,质软。肝组织切片镜下显示,生理盐水组小鼠肝组织中可见大量的虫卵肉芽肿形成,肉芽肿体积较大,周围有大量炎细胞浸润,大量的肝细胞变性坏死,pcDNA3.1(+)-SjP14组肝脏病变较生理盐水组明显减轻,pcDNA3.1(+)-SjP14纳米微球组肝脏损伤程度最轻,肝小叶结构基本完整,虫卵肉芽肿周围炎症反应轻,肉芽肿面积较小。结论:本研究成功地构建pcDNA3.1(+)-SjP14-纳米微球复合物, pcDNA3.1(+)-SjP14核酸疫苗有一定程度的抗血吸虫感染作用,pcDNA3.1(+)-SjP14-纳米微球复合物疫苗免疫能增强小鼠对血吸虫感染的保护性免疫力。

全文目录

中英文词汇对照表 4-5中文摘要 5-7英文摘要 7-101 前言 10-162 材料与方法 16-32 2.1 实验材料 16-21 2.1.1 阳性钉螺 16 2.1.2 实验动物 16 2.1.3 重组质粒菌株 16 2.1.4 试剂及来源 16-17 2.1.5 实验所用仪器 17-18 2.1.6 部分试剂配制 18-21 2.2 方法 21-32 2.2.1 重组质粒的提取和鉴定 21-22 2.2.2 重组质粒的转染和鉴定 22-27 2.2.3 无内毒素裸露 DNA 疫苗的制备 27-28 2.2.4 纳米微球-DNA 复合物的制备 28-29 2.2.5 DNA 疫苗在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护作用效果观察 29-323. 结果 32-38 3.1 重组质粒的酶切鉴定 32 3.2 阳性细胞克隆的 RT-PCR 鉴定 32-33 3.3 阳性细胞克隆的 Western blotting 鉴定 33-34 3.4 pcDNA3.1(+)-SjP14-微球载药量的测定 34 3.5. 减虫率(表 1) 34 3.6 减卵率(表2) 34-35 3.7 小鼠血清抗体(IgG1、IgG2a、总 IgG)水平的变化 35-36 3.8 小鼠肝脏照片 36-37 3.9 小鼠肝脏切片 HE 染色 37-384 讨论 38-435 结论 43-44参考文献 44-50附录一个人简历 50-51附录二致谢 51-52综述 52-62 参考文献 59-62

日本血吸虫P14基因纳米微球-DNA疫苗的初步研究

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