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高温酸性α-淀粉酶基因的定向突变及在地衣芽孢杆菌中的表达

作　者: 牛丹丹
导　师: 王正祥
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 高温酸性α-淀粉酶 密码子偏好性 定向突变 表达
分类号: TQ920.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


耐高温α-淀粉酶是目前最重要的工业酶制剂之一,广泛应用于发酵、制糖等工业。Pyrococcus furiosus产生的胞外α-淀粉酶(PFA)具有耐热性能好、最适pH低和钙离子不依赖性。本文主要针对异源高表达PFA编码基因的关键基础问题进行研究。以大肠杆菌为例,研究其tRNA组成的变化对PFA表达的影响。将重组质粒pET-PFA转化大肠杆菌DE3 CondonPlus-RIL,PFA表达量提高约9倍,验证了胞内tRNA的组成影响PFA的表达水平。根据PFA编码基因的序列及地衣芽孢杆菌密码子使用频率,对PFA编码基因的密码子进行全面改组,即将PFA编码基因中使用的地衣芽孢杆菌稀有密码子改为相应的同义密码子。在计算机的协助下,运用DNAMAN软件设计全基因合成寡核苷酸,共78条寡核苷酸。经过组合反应和特异性PCR扩增技术,获得全合成的DNA片段。将此扩增片段克隆入pBlueScript SK(-),得到pSK-amyF。测序结果表明,全合成基因的核苷酸序列与实验设计完全一致,与原始PFA编码基因的核苷酸序列存在9.62%的差异。进一步研究了amyF在以地衣芽孢杆菌为宿主细胞中的表达。重组质粒pSK-amyF经EcoR I和Sma I酶切后,通过胶回收得到amyF。将amyF克隆入质粒pBL-WZX的EcoR I和Sma I处,获得在地衣芽孢杆菌中表达的整合型表达pBL-amyF。再以pBL-amyF为模板扩增出片段PamyL-SamyL-amyF-Tart-?Km-3’amyL’,克隆入pHY300PLK中形成游离型表达质粒pHY-amyF。重组质粒pBL-amyF和pHY-amyF纯化后,通过电转化方法转化地衣芽孢杆菌。转化混合物涂布在5μg/mL的卡那霉素的LB平板筛选出阳性转化子。对重组α-淀粉酶的酶学性质进行了初步研究,结果表明重组酶的最适pH5.0,最适温度95-98oC,与天然PFA基本相似。重组菌的产酶水平较前期研究有了很大的提高。

全文目录


中文摘要  5-6
Abstract  6-7
1 前言  7-15
  1.1 淀粉水解工业的主要加工工序  7-9
  1.2 高效淀粉液化工艺要求α-淀粉酶具有新的性能  9
  1.3 α-淀粉酶分子改性的研究概况  9-11
    1.3.1 BLA 热稳定的分子基础和分子改性  10-11
    1.3.2 适应低pH 环境的分子改性  11
  1.4 酶分子改性技术的研究和应用概况  11-12
  1.5 具有新性能的天然α-淀粉酶的筛选  12-13
  1.6 本研究立题背景和依据  13-15
2. 材料和方法  15-25
  2.1 菌株和质粒  15
  2.2 工具酶和试剂  15-16
    2.2.1 酶和试剂盒  15
    2.2.2 质粒提取与纯化试剂  15
    2.2.3 蛋白电泳试剂  15-16
  2.3 培养基和培养条件  16-17
  2.4 B. licheniformis 染色体的提取  17
  2.5 质粒DNA 的提取  17
  2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化  17-18
    2.6.1 感受态细胞制备  18
    2.6.2 转化  18
  2.7 地衣芽孢杆菌转化  18-19
  2.8 amyF 基因的合成与重组质粒的构建  19-23
    2.8.1 amyF 基因的全合成  19-22
    2.8.2 应用于amyF 表达的重组质粒的构建  22-23
  2.9 常见分子克隆操作  23
  2.10 发酵试验  23
  2.11 耐高温α-淀粉酶酶活测定  23
  2.12 SDS-PAGE  23-24
  2.13 主要仪器  24-25
3 结果和讨论  25-38
  3.1 不同生物体同义密码子使用频率存在较大差异  25-27
  3.2 改善宿主细胞胞内氨基酰tRNA 池有助于提高异源基因表达水平  27-28
  3.3 PFA 编码基因的分子改造  28-32
  3.4 重组质粒pBL-amyF 和pHY-amyF 的构建  32-36
  3.5 重组菌的构建和初步发酵试验  36-38
论文主要结论  38-39
参考文献  39-42
致谢  42-43
硕士研究生期间在科学技术期刊上发表的文章  43

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 一般性问题 > 基础理论
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