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日本血吸虫23KD膜蛋白的原核表达与纯化及双价膜锚定型和分泌型表达疫苗抗感染效果的比较研究

作　者: 邹镇
导　师: 戴五星
学　校: 华中科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 日本血吸虫 23KD膜蛋白逆转录基因表达亲和层忻膜锚定型表达疫苗分泌型表达疫苗抗感染效果
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的构建日本血吸虫23KD膜蛋白基因的原核表达质粒pET-₂8a-sj23，将其转化大肠杆菌BL-21（DE3），诱导其表达并纯化此蛋白，为制备亚单位疫苗和检测特异性抗体及细胞因子提供抗原。方法采用RT-PcR的方法，以日本血吸虫成虫总RNA为模板，扩增得到sj23基因，并克隆至PMDl8-T载体中，经BamH I和EcoR I双酶切后定向克隆于原核表达质粒pET-28a，构建成pET-sj23质粒，并将此质粒转化大肠杆菌BL-21 （DE3），使用IPTG诱导蛋白表达，sDs-PAGE观察其表达状态，镍柱亲和层忻纯化此蛋白，BcA法测定纯化蛋白浓度。结果成功构建原核表达质粒pET-28a-sj23，并转化至大肠杆菌BL-21（DE3），sDs-PAGE显示经IPTG诱导之后成功表达出约31.3kD左右的融合蛋白（其中N-端含有8 kD的原核多肽），亲和层忻纯化重组蛋白，浓度为O.8 mg／ml。结论成功制备了sj23抗原，为亚单位疫苗的研究及特异性抗体和细胞因子的检测打下了基础。目的比较膜锚定型pIREs-sj14-Sj26表达疫苗和分泌型pIREs-sj14-Sj26，表达疫苗在血吸虫感染BALB／c小鼠体内的抗感染效果，初步探讨膜锚定与分泌型的疫苗的作用效果和可能机制。方法大量提取并纯化膜锚定型pIREs-sj14-Sj26表达质粒、分泌型pIREs-sj14-Sj26，表达质粒以及空pIREs质粒，并用此三种质粒肌肉注射免疫BALB／c小鼠，每组10只，并设置生理盐水组作为空白对照组。每隔2周加强免疫1次，共免疫3次。完成免疫后，每只小鼠经腹部感染40土1条尾蚴，尾蚴攻击感染45d后，各组小鼠经肠系膜静脉灌注法和压片法收集血吸虫成虫，并留取肝脏备用。分别计算每只小鼠中收集的血吸虫成虫数，计算每组小鼠的平均成虫数，按下式计算减虫率：减虫率=（对照组平均获成虫数．实验组平均获成虫数）／对照组平均检获成虫数×100%。称取鼠肝总重量，按常规方法用5%氢氧化钾消化肝组织，计算每克肝组织虫卵数（EPG），按下式计算减卵率：减卵率=（对照组平均EPG-实验组平均EPG）／对照组平均EPG×100%。结果膜锚定表达疫苗组减虫率和减卵率较分泌表达疫苗组有所增加，但无显著性差异（P>0.05），较空载体组和生理盐水组的差异有极显著性意义（P<0.01）；结论膜锚定型表达疫苗pIREs-sj14-Sj2e，组较分泌型表达疫苗可能能诱导小鼠产生更为有效的抗日本血吸虫感染的保护作用。

全文目录

主要缩写词  5-6
第一部分日本血吸虫23kD膜蛋白的原核表达与纯化  6-32
  中文摘要  6-7
  英文摘要  7-8
  前言  8-10
  材料和方法  10-22
  结果  22-26
  讨论  26-29
  参考文献  29-32
第二部分日本血吸虫双价膜锚定型和分泌型表达疫苗  32-45
  中文摘要  32-33
  英文摘要  33-34
  前言  34-36
  材料和方法  36-39
  结果  39-40
  讨论  40-43
  参考文献  43-45
小结  45-46
综述  46-60
  参考文献  55-60
致谢  60

日本血吸虫23KD膜蛋白的原核表达与纯化及双价膜锚定型和分泌型表达疫苗抗感染效果的比较研究

内容摘要

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