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腺相关病毒载体介导变异体DHFR和GFP融合基因入人外周血干/祖细胞的实验研究

作　者: 李黎波
导　师: 冯茹
学　校: 第一军医大学
专　业: 内科血液学
关键词: 腺相关病毒绿色荧光蛋白变异体二氢叶酸还原酶基因转染 CD34~+细胞耐药氨甲蝶呤
分类号: R457.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
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内容摘要

目的：在以造血干细胞为靶细胞的基因治疗中，如何将外源基因导入静止状态的造血干细胞中是目前面临的最大障碍之一。人类造血干细胞中的二氢叶酸还原酶（DHFR）基因表达水平不足以对抗氨甲喋呤（MTX）引起的造血功能抑制~[1]。以腺相关病毒（AAV）为载体，将22和31位置双突变的DHFR（mDHFR）和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因导入外周血造血干细胞，达到保护机体造血功能的目的，同时建立一个简便、易行的检测目的基因的体系。方法：构建携带人mDHFR和GFP融合基因的重组腺相关病毒载体（rAAV/mDHFR-GFP），经293细胞包装成重组病毒；将重组病毒分别感染NIH3T3细胞和人外周血来源的CD34~+细胞，经PCR检测，NIH3T3细胞中含有人mDHFR和GFP cDNA；RT-PCR证实转染后的CD34~+细胞中含有mDHFR和GFPmRNA。用MTX加压培养，MTT法显示了人mDHFR在两种细胞中均有表达，转基因组与未转基因组耐药性有一定差异，经流式细胞仪和荧光显微镜观察基因转染率。结果：1．成功用甘氨酸LINKER连接mDHFR和GFP产生相应的融合基因，构建了rAAV/mDHFR-GFP重组载体，并成功表达。2．PCR证实腺相关病毒载体可将mDHFR-GFPcDNA导入外周血造血干祖细胞。3．RT-PCR证实病毒转染后的CD34~+细胞中有mDHFR和GFPmRNA的存在，表明导入的目的基因在靶细胞内的确切存在。4．rAAV/mDHFR-GFP重组病毒分别感染NIH3T3细胞和外周血CD34~+细胞，感染率可高达25％，外周血CD34~+细胞中可见绿色荧光蛋白表达。5．MTT法证实转基因细胞耐药性较未转基因细胞有一定提高。结论：甘氨酸LINKER将两个不同的基因片段连接成功，腺相关病毒载体可将mDHFR-GFP融合基因成功导入外周血干祖细胞，转入的目的基因在靶细胞中可有效表达，产生相应有功能的物质（包括蛋白质），使经转染的外周血干祖细胞对MTX的耐药性增强，今后仍需进一步改善AAV结构、包装系统和基因转染技术，以提高基因转导效率。

全文目录

缩略名词注释  3-4
中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
引言  8-11
实验材料  11-16
实验方法  16-29
结果  29-41
讨论  41-49
结论  49-50
参考文献  50-56
致谢  56-57
附录1：文献综述  57-63
附录2：研究生在读期间论文发表情况  63-64
附图  64-73

腺相关病毒载体介导变异体DHFR和GFP融合基因入人外周血干/祖细胞的实验研究

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