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复混肥中缩二脲对作物毒害的临界值与缩二脲降解菌的研究

作　者: 平泉瑞
导　师: 黄为一
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 缩二脲作物毒害剂量降解菌绿色荧光蛋白定殖
分类号: S143
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

缩二脲是肥料中的一种对作物有毒害的物质,已被大家所公认。缩二脲的产生是由于尿素生产过程中或作为生产复混肥料氮源的尿素在造粒过程中温度过高缩合而成。肥料中过高的缩二脲含量使小麦、玉米等肥害事件屡次发生,经济损失严重。尿素质量的国家标准(GB 2440—91)对缩二脲含量有硬性要求,尿素中缩二脲含量大于1.5%时为不合格产品,但复混肥质量标准中还没有制定相关的限制性定量指标。目前缩二脲对作物造成的毒害作用还没有比较好的解决方法,传统的补救措施是采用灌水排毒或耕耙分散毒素,使缩二脲浓度降低,补种或改种其它作物,最后补施一些优质氮磷钾肥料。采用生物修复将缩二脲降解成无毒害作用的含氮化合物是一种有效的手段。土壤脲酶不能水解缩二脲,所以缩二脲在土壤中的降解速度很慢,好氧条件下5-8周内只有15-21%的外加缩二脲能被转化。但有关文献表明反刍动物瘤胃培养条件下存在着脲酶以外的降解缩二脲反应。本研究期望：1.找到复混肥中缩二脲对作物毒害作用的临界值,为制定复混肥国家标准提供数量化的科学依据。2.采用一种简便的检测方法从土壤中筛选出能够高效降解缩二脲的菌株。3.对获得的高效降解缩二脲菌株进行绿色荧光蛋白标记,跟踪其在土壤中的定殖行为。通过水培和盆栽试验方法对冬小麦、玉米、番茄、油菜、水稻五种供试作物耐缩二脲毒害作用的临界值进行测定,在适宜的施肥条件下,水培试验表明：1L水溶液中缩二脲含量大于35mg、40mg、20mg、15mg、15mg时,会对相应作物生长造成显著毒害。盆栽试验显示：复混肥中缩二脲含量对相应作物生长造成显著毒害作用的临界值为1.6%、2.0%、2.0%、2.0%、2.0%。考虑到氯离子等影响因素的存在,建议复混肥中缩二脲含量应控制在1%以下。采用以缩二脲作为唯一氮源筛选出耐高浓度缩二脲的菌株,通过比对耐缩二脲菌株在添加和不添加缩二脲作为底物的无氮培养基中的生长状态初步确定是否利用缩二脲,最后结合发酵液中氨态氮的蒸馏滴定法以及发酵液中缩二脲含量的高效液相色谱定量分析法从新疆农大试验田、河南焦作肥料厂、南京农业大学校园内的供试土壤以及本实验室保存的菌株中筛选到一株高效缩二脲降解菌,通过对菌株进行生理生化和16S rDNA序列分析,初步鉴定为克雷伯氏菌属(Klebsiella),编号为GW-1. GW-1菌株在LB培养基、无氮培养基和以缩二脲为唯一氮源的无氮培养基上均可正常生长,在含缩二脲的无氮培养基上生长时7h进入对数生长期,其最适生长温度为28℃,最适pH为7.10,大接种量和溶氧量能促进GW-1菌株的生长,好氧条件下在缩二脲含量为500mg/L的无氮培养基中培养20h后,GW-1培养上清液中缩二脲降解率达76.98%,34h时降解率达100%,GW-1菌株具有很强的缩二脲降解能力。通过三亲结合对GW-1菌株成功进行了gfp基因标记,标记菌株编号为GW-1-GFP,通过对野生型菌株和标记菌株的形态学特征、质粒图谱、荧光检测和降解缩二脲能力的比较,发现GW-1菌株已获得gfp标记的质粒,且标记菌株GW-1-GFP降解缩二脲的能力与野生型菌株无明显差别。GW-1-GFP菌株在发挥降解缩二脲功能的同时能够在土壤中作物根际很好地定殖,随着时间的推移,第45天时GW-1-GFP菌株在土壤中未被检测到。未发现GW-1-GFP菌株对土壤中原有微生物的生长产生影响。发酵有机肥对GW-1-GFP菌株在土壤中的定殖有一定的促进作用,且明显提高了土著微生物中芽孢杆菌数量。GW-1-GFP菌株接种作物种子试验表明其与作物根部有很好的亲和性,对作物生长也有很好的促生效果。经高效液相色谱分析测定发现,GW-1-GFP菌株在各处理土壤条件下25天时降解缩二脲的能力达到50%以上,GW-1-GFP菌株能够在土壤中很好地起到降解缩二脲的效果。通过盆栽试验发现GW-1-GFP菌株能够很好地缓解缩二脲对作物的毒害作用,与CK相比,添加GW-1-GFP菌株后,促进K、P元素的吸收。

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摘要 7-9ABSTRACT 9-11缩略语 11-12第一章文献综述 12-34 第一节缩二脲的性质、用途和制备方法 12-14 1 缩二脲的基本性质 12 2 缩二脲的用途 12-13 3 缩二脲的生产工艺 13 4 常见的两种合成工艺流程图 13-14 第二节肥料产品标准中缩二脲含量概况 14-15 1 尿素标准中缩二脲含量的控制 14 2 复混肥标准中缩二脲含量的控制 14-15 3 复混肥生产过程中缩二脲产生的原因 15 第三节不同肥料产品中缩二脲含量的测定方法 15-18 1 尿素中缩二脲含量的测定方法 15-16 2 复混(合)肥中缩二脲含量的测定方法 16-18 第四节缩二脲对作物的影响及其机理 18-22 1 高浓度缩二脲对小麦生长的影响 18-19 2 高浓度缩二脲对玉米生长的影响 19-20 3 高浓度缩二脲对水稻和烤烟生长的影响 20 4 缩二脲对花旗松秧苗生长和养分吸收的影响 20-21 5 缩二脲对植物和作物影响的方式 21 6 尿素商品的缩二脲含量及其含量控制要求 21-22 第五节解决缩二脲毒害的方法 22 1 传统的补救处理方法 22 2 微生物降解的处理方法 22 第六节生物修复土壤环境的研究进展 22-27 1 生物修复的定义 22-23 2 生物修复的原理 23 3 生物修复的优点和制约因素 23-24 4 生物修复的分类 24 5 生物修复技术种类 24-27 6 生物修复的应用前景及进一步发展方向 27 第七节微生物在作物根际定殖示踪研究进展 27-30 1 核酸探针检测技术 28 2 利用引物的PCR技术 28 3 DNA序列分析 28 4 免疫学方法 28 5 基因标记 28-30 第八节绿色荧光蛋白标记方法在功能微生物环境保护方面的应用 30-31 1 GFP的发现和首次应用 30 2 GFP的表达具有广谱性特点 30 3 GFP在环境微生物方面的应用方向和实例 30-31 第九节本研究目的意义和设计路线 31-34 1 目的意义 31-32 2 研究思路和技术路线 32-34第二章复混肥中缩二脲含量对作物生长的影响 34-54 1 材料与方法 34-37 1.1 材料 34-35 1.2 方法 35-37 2 结果与分析 37-52 2.1 复混肥中缩二脲含量的测定结果 37-38 2.2 复混肥中缩二脲对冬小麦生长的影响 38-42 2.3 复混肥中缩二脲对玉米生长的影响 42-45 2.4 复混肥中缩二脲对番茄生长的影响 45-47 2.5 复混肥中缩二脲对油菜生长的影响 47-50 2.6 复混肥中缩二脲对水稻生长的影响 50-52 3 讨论 52-53 4 小结 53-54第三章缩二脲降解菌的筛选与鉴定 54-76 1 材料与方法 54-59 1.1 材料 54-55 1.2 方法 55-59 2 结果与分析 59-73 2.1 缩二脲降解菌的分离和筛选 59-69 2.2 菌株的生理生化特性鉴定和16S rDNA序列分析 69-73 2.3 耐缩二脲和缩二脲降解菌占可培养微生物的比例 73 3 讨论 73-74 4 小结 74-76第四章缩二脲降解菌株GW-1的生物学特性研究 76-84 1 材料和方法 76-79 1.1 材料 76-77 1.2 方法 77-79 2 结果和分析 79-83 2.1 GW-1菌株在筛选培养基和LB培养基中的生长曲线 79-80 2.2 GW-1菌株在筛选培养基中最适生长条件 80-81 2.3 GW-1菌株的生物学特性研究 81-82 2.4 GW-1菌株对抗生素的抗性 82-83 3 讨论 83 4 小结 83-84第五章 GFP基因标记缩二脲降解菌GW-1菌株 84-94 1 材料和方法 84-88 1.1 材料 84-85 1.2 方法 85-88 2 结果和分析 88-92 2.1 标记菌株的构建 88 2.2 标记菌株的验证 88-89 2.3 标记菌株质粒的遗传稳定性试验 89 2.4 标记菌株GW-1-GFP与原始菌株GW-1好氧条件下的生长情况 89-90 2.5 GW-1和GW-1-GFP于筛选固体培养基中培养2d的生长情况 90 2.6 GW-1和GW-1-GFP于筛选培养液中缩二脲降解情况 90-92 3 讨论 92-93 4 小结 93-94第六章缩二脲降解菌GW-1-GFP在土壤中的定殖以及对土壤微生物的影响研究 94-102 1 材料和方法 94-96 1.1 材料 94-95 1.2 方法 95-96 2 结果与分析 96-100 2.1 不同时间段GW-1-GFP在土壤中的定殖情况 96-97 2.2 GW-1-GFP菌株在小麦根部的定殖情况和对玉米的促生效果 97-99 2.3 GW-1-GFP菌株对土壤中可培养细菌、真菌、放线菌种类的影响 99-100 3. 讨论 100 4 小结 100-102第七章缩二脲降解菌GW-1-GFP缓解缩二脲对作物毒害作用的研究 102-110 1 材料和方法 102-104 1.1 材料 102 1.2 方法 102-104 2 结果与分析 104-108 2.1 GW-1-GFP菌株在土壤中定殖20天时的缩二脲降解情况 104-106 2.2 盆栽试验中的玉米生长一段时间后,各处理的生长指标情况 106-107 2.3 不同处理间玉米地上部分和地下部分K、P、Mg、Ca、Na的测定结果 107-108 3 讨论 108 4 小结 108-110第八章全文总结与研究展望 110-112 1 全文结论 110 2 研究中存在的主要问题 110 3 未来研究工作的展望 110-112参考文献 112-120攻读硕士期间发表的文章和投送的论文 120-122致谢 122

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