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重组人Ⅱ型胶原250-270多肽的基因构建和表达的研究

作　者: 王宏坤
导　师: 朱平；陈常庆
学　校: 第四军医大学
专　业: 内科学（风湿病学）
关键词: II型胶原蛋白类风湿性关节炎口服耐受表达重组人II型胶原蛋白 250－270多肽
分类号: R593.22
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
下　载: 66次
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内容摘要

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种自身免疫性疾病，Ⅱ型胶蛋白（type Ⅱ collagen，CⅡ）是RA的自身抗原之一，在疾病发展和治疗研究中都有重要的作用。为了成功地高效表达和分离纯化重组人Ⅱ型胶原蛋白250-270多肽（recombinant human collagen type Ⅱpeptide 250-270，rhCⅡ250-270），为口服耐受治疗RA的基础和临床研究提供大量可用的研究材料，本文采用DNA合成、聚合酶链式反应（polymerasechain reaction，PCR）、重组DNA技术、DNA序列测定、亲和层析等技术方法，成功构建rhCⅡ250-270的多聚目的基因，研究其在大肠杆菌（escherichia coli，E.coli）中的表达条件，并分离纯化获得所需的表达产物。主要研究内容如下：本文为高效表达rhCⅡ250-270，在基因构建时，就采取了一些方法对目的基因进行优化。采用E.coli偏爱密码子，通过化学合成和PCR技术，第四军医大学硕士学位论文构建rhC 11 250－270的目的基固，并重组到pUC19质粒中，测序结果证实目的基因序列与设计的完全相同；利用同裂酶 salnHI和 Bgl 11相同的粘性末端，将单聚目的基因片段在重组质粒上依次串联成多聚目的基因，测序结果证实多聚目的基因序列与预期的相符。在表达研究中，通过比较 rbC 11 250－27D在不同类型的表达载体上及不同 E COil宿主菌中的表达量，发现以非融合方式表达时，无论是化学诱导（PKKH）或温控诱导（PBV220），在不同宿主菌中表达量都很低，且表达产物的可溶性很差；YX融合方式表达一GEX叶T－1和 PGEX一T七）时，表达量明显提高，表达产物的可溶性较好，但在不同宿主菌中的差异很大。选择融合表达的 BLZIL程菌进行表达条件的优化研究，发现培养温度对表达量的影响最大。在优化的条件进行表达下，SDS干AGE结果显示，表达产物大。J、约为43kD，与预期的相符，表达量约为30％，可溶性在80％以上。利用GST亲和层析法对表达产物进行纯化，纯化后的融合蛋白纯度可达90％以上。本研究是首次利用基固工程的方法对人 11型胶原蛋白（HllC 11）的功能性多肽进行重组表达和分离纯化，并对胶原蛋白在原核细胞中的表达条件进行了初步模索，为以后的同类研究提供了经验。同时，本研究也为口服耐受治疗RA的基础和临床研究提供大量的研究材料。

全文目录

英文缩略语表  3-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
前言  9-11
文献回顾  11-70
  第一部分 rhCⅡ250-270多肽多聚基因的构建和鉴定  34-55
    材料和方法  34-42
    结果  42-52
    讨论  52-55
  第二部分 rhCⅡ250-270多肽多聚基因的表达和纯化  55-70
    材料和方法  55-61
    结果  61-68
    讨论  68-70
小结  70-71
致谢  71-72
参考文献  72-83
附录  83-90

重组人Ⅱ型胶原250-270多肽的基因构建和表达的研究

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