学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

天然海鱼共附生放线菌农用活性菌株的分离、筛选及分类鉴定

作　者: 杜丹超
导　师: 欧阳明安
学　校: 福建农林大学
专　业: 农药学
关键词: 海洋鱼类放线菌抗真菌菌种鉴定发酵
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 64次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载

内容摘要

海洋覆盖全球面积的70%,蕴含丰富的海洋微生物资源。海洋来源放线菌是一类有重要价值的微生物资源,其丰富的次级代谢产物是寻找新型抗生素的重要来源。海洋鱼类作为海洋生态环境中的重要组成部分、洄游性和杂食性等生活习性使其体内富集了大量的共附生微生物,成为我们获取海洋来源微生物的载体。不同鱼种由于其生活习性(水深、食性、洄游性等)不同,其共附生微生物群落可以在一定程度上反映不同的海洋生态环境微生物群落信息。由此我们将海洋鱼类共附生微生物作为海洋微生物研究便捷的菌种来源途径。本研究以福建平潭周边海域海洋鱼类作为海洋放线菌分离来源,分离获取具有开发利用价值的海鱼共附生放线菌天然菌种。先后采用7种放线菌分离培养基以及不同的抗生素组合,共分离纯化获得海洋鱼类共附生放线菌29株。通过平板对峙法和抑制菌丝生长速率法筛选出具有抑菌活性的放线菌19株；其中,菌株030603是我们筛选得到的具有高效、广谱性抑制植物病原真菌活性的放线菌野生菌株。发酵液粗提物在0.12～6.61g/L对小麦纹枯(Rhizoctonia cerealis)等14种供试植物病原真菌具有明显的抑菌活性,其中对小麦全蚀(Ophiclus graminis)有高效抑菌活性,EC50值达到0.12g/L。进一步对分离到的29株海洋鱼类共附生放线菌进行了抗烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus, TMV)和抗肿瘤活性筛选。筛选出对烟草花叶病毒增殖的抑制率达到50%以上的活性菌株6株；通过MTT法筛选到一株抗胃癌SGC-7901高效活性野生菌株042403,在供试浓度500μg／mL下,发酵液粗提物与菌丝体粗提物抑制活性分别达97.67%和99.5%。同时,结合培养形态、生理生化实验和16S rDNA对活性菌株010204、020101、030603、042403进行分类鉴定,初步鉴定结果为假浅灰链霉菌Streptomyces pseudogriseolus 010204,球孢链霉菌Streptomyces globisporus020101,微白黄链霉菌属Streptomyces albidoflavus 030603,吸水链霉菌属Streptomyces. hygroscopicus 042403。另外对活性菌株030603,以小麦纹枯为靶标菌,进行了发酵工艺的优化。采用单因子试验与正交设计相结合的方法,确定菌株030603液体发酵培养基组成及培养条件为：黄豆粉1.5%,蛋白胨3%,甘油1.5%,可溶性淀粉2%,盐度0%.,PH 5-7,种龄2d,接种量：6%,培养时间：5d,250mL三角瓶装液量75mL。菌株030603发酵优化后,次级代谢产物粗提物(1 mg/mL)对小麦纹枯病菌的抑菌活性达到98.78%,较基础发酵培养基抑菌活性(87.5%)有大幅度的提高。

全文目录

摘要  10-12
Abstract  12-14
1 前言  14-26
  1.1 农用抗生素的发展与现状  14
  1.2 海洋微生物农用生物活性次生代谢产物研究  14-19
    1.2.1 海洋微生物抑菌活性物质  14-17
      1.2.1.1 来源于海洋放线菌的抑菌物质  15-16
      1.2.1.2 来源于海洋细菌的抑菌物质  16-17
      1.2.1.3 来源于海洋真菌的抑菌物质  17
    1.2.2 海洋微生物抗植物病毒活性物质研究  17-18
    1.2.3 海洋微生物代谢产物杀虫活性研究  18-19
    1.2.4 海洋微生物代谢产物除草活性研究  19
  1.3 海洋微生物多样性及分子鉴定手段  19-25
    1.3.1 海洋微生物的物种多样性  19-21
    1.3.2 海洋微生物遗传多样性  21
    1.3.3 海洋微生物分子鉴定  21-25
      1.3.3.1 16S rRNA序列测定  22
      1.3.3.2 DGGE和TGGE  22-23
      1.3.3.3 RFLP和ARDRA  23-24
      1.3.3.4 LMW RNA  24
      1.3.3.5 RAPD  24
      1.3.3.6 ERIC-PCR  24-25
  1.4 本研究的目的和意义  25-26
2 材料与方法  26-42
  2.1 实验材料  26-27
    2.1.1 供试植物病原菌  26
    2.1.2 抗TMV供试寄主、供试毒源  26
    2.1.3 抗肿瘤活性供试细胞株  26
    2.1.4 试剂  26-27
    2.1.5 仪器  27
  2.2 海洋放线菌的分离与筛选  27-28
    2.2.1 样品的采集与处理  27-28
      2.2.1.1 样品来源  27-28
    2.2.2 海洋鱼类放线菌的分离  28
      2.2.2.1 分离方法  28
      2.2.2.2 菌株保存  28
  2.3 菌株的发酵与次生代谢物质粗提物的制备  28-29
    2.3.1 菌株发酵液的制备  28
    2.3.2 菌株次生代谢产物活性物质的粗提取  28-29
  2.4 海洋鱼类共附生放线菌活性菌株筛选  29-32
    2.4.1 抑植物病原真菌活性测定  29
      2.4.1.1 平板对峙法  29
      2.4.1.2 抑制菌丝生长速率法  29
    2.4.2 抗TMV增殖活性测定  29-30
      2.4.2.1 病毒浓度标准曲线的制作  29-30
      2.4.2.2 抗病毒增殖作用的测定  30
    2.4.3 抗肿瘤活性测定  30-32
      2.4.3.1 肿瘤细胞的冻存  30
      2.4.3.2 肿瘤细胞的复苏  30-31
      2.4.3.3 肿瘤细胞的传代及培养  31
      2.4.3.4 肿瘤细胞生长曲线测定  31
      2.4.3.5 抗肿瘤活性检测  31-32
  2.5 活性菌株的分类鉴定  32-39
    2.5.1 形态学特征  32
    2.5.2 生理生化特征  32-34
      2.5.2.1 明胶液化  32
      2.5.2.2 淀粉水解  32
      2.5.2.3 牛奶凝固  32-33
      2.5.2.4 黑色素产生  33
      2.5.2.5 硝酸盐还原  33
      2.5.2.6 过氧化氢(接触酶)实验  33
      2.5.2.7 纤维素分解  33
      2.5.2.8 碳源利用  33-34
    2.5.3 放线菌16S rDNA序列测定及系统发育分析  34-39
      2.5.3.1 基因组DNA提取过程  34-35
      2.5.3.2 16S rDNA目的片段PCR扩增、PCR产物纯化  35
      2.5.3.3 目的片段回收  35-36
      2.5.3.4 连接反应  36-37
      2.5.3.5 DH5α感受态细胞的制备  37
      2.5.3.6 连接产物的转化  37
      2.5.3.7 重组质粒的小提取  37-38
      2.5.3.8 双酶切反应验证  38
      2.5.3.9 16S rDNA测序结果的系统发育树分析  38-39
  2.6 菌株030603合成抑菌活性物质的发酵工艺优化  39-42
    2.6.1 培养条件  39
    2.6.2 活性检测方法  39
    2.6.3 培养成分对菌株030603合成抑菌活性物质的影响  39-40
      2.6.3.1 碳源浓度的影响  39
      2.6.3.2 不同氮源的影响  39
      2.6.3.3 碳源浓度的影响  39
      2.6.3.4 氮源浓度的影响  39-40
      2.6.3.5 碳氮源正交优化实验  40
      2.6.3.6 无机盐对菌株030603产活性物质的影响  40
    2.6.4 培养条件对菌株030603产活性物质的影响  40-42
      2.6.4.1 初始PH对菌株030603产活性物质的影响  40
      2.6.4.2 接种量对菌株030603产活性物质的影响  40
      2.6.4.3 装液量对菌株030603产活性物质的影响  40-41
      2.6.4.4 种龄对菌株030603产活性物质的影响  41
      2.6.4.5 发酵时间对菌株030603产活性物质的影响  41-42
3 结果与分析  42-65
  3.1 海洋鱼类放线菌的分离及其抗植物病原真菌菌株的筛选  42-48
    3.1.1 海洋鱼类放线菌的分离  42-43
    3.1.2 培养基的选择  43
    3.1.3 抑制植物病原真菌的活性菌株筛选  43-45
    3.1.4 菌株030603次级代谢产物的广谱抗菌活性  45
    3.1.5 抗TMV活性菌株筛选  45-46
    3.1.6 抗肿瘤活性菌株筛选  46-47
    3.1.7 菌株正丁醇提取物甲醇提取物抗肿瘤活性  47-48
  3.2 活性菌株的分类鉴定  48-58
    3.2.1 菌株010204的分类鉴定  48-50
      3.2.1.1 形态学鉴定  48-49
      3.2.1.2 生理生化特征  49
      3.2.1.3 菌株010204的16S rDNA系统发育分析及鉴定结果  49-50
    3.2.2 菌株020101的分类鉴定  50-52
      3.3.2.1 形态学鉴定  50
      3.2.2.2 生理生化特征  50
      3.2.2.3 菌株020101的16S rDNA系统发育分析及鉴定结果  50-52
    3.2.3 菌株030603的分类鉴定  52-54
      3.2.3.1 形态学鉴定  52
      3.2.3.2 生理生化特征  52-54
      3.2.3.3 菌株030603的16S rDNA系统发育分析及鉴定结果  54
    3.2.4 菌株042403的分类鉴定  54-58
      3.2.4.1 形态学鉴定  54-56
      3.2.4.2 生理生化特征  56
      3.2.4.3 菌株042403的16S rDNA系统发育分析及鉴定结果  56-57
      3.2.4.4 16S rDNA序列测定  57-58
  3.3 菌株030603发酵优化  58-65
    3.3.1 培养基组成对菌株030603产活性物质的影响  58-61
      3.3.1.1 碳源对菌株030603产活性物质的影响  58-59
      3.3.1.2 不同氮源对菌株030603产活性物质的影响  59-60
      3.3.1.3 碳氮源正交优化实验  60-61
      3.3.1.4 无机盐对菌株030603产活性物质的影响  61
    3.3.2 培养条件对菌株030603产活性物质的影响  61-65
      3.3.2.1 培养基初始PH对菌株030603产活性物质的影响  61-62
      3.3.2.2 装液量和接种量对菌株030603产活性物质的影响  62-63
      3.3.2.3 种龄对菌株030603产活性物质的影响  63
      3.3.2.4 发酵时间对菌株030603产活性物质的影响  63-65
4 讨论  65-68
  4.1 海洋鱼类放线菌的分离  65
  4.2 活性菌株的筛选  65-66
  4.3 活性菌株的分类鉴定  66-67
  4.4 菌株030603发酵工艺的优化  67-68
5 结论  68-69
参考文献  69-73
致谢  73-74
附录一菌株16S rDNA序列  74-77
附录二常用溶液  77-83
附录三菌株分类鉴定特征  83-90
附录四 030603次代谢产物粗提物抑植物病原真菌图片  90-91

天然海鱼共附生放线菌农用活性菌株的分离、筛选及分类鉴定

内容摘要

全文目录

相似论文