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两株真菌的次生代谢产物研究

作　者: 周洋
导　师: 郭坚华
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 耙齿菌拟茎点霉固体发酵甾醇脑苷脂
分类号: S482
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

微生物资源的生物多样性决定其代谢产物的结构多样性和生物活性多样性。真菌作为微生物区系中重要的一员,种类多,分布广,产生的次生代谢产物具有多种生物活性,如抗菌、抗肿瘤、调节植物生长等。本文研究了两株真菌的次生代谢产物。其中菌株443是由实验室人员分离自江苏宿迁番茄根围土中,通过形态学结合分子生物学鉴定为耙齿菌(Irpex sp.)。另外一株By254是植物内生真菌拟茎点霉(Phomopsis sp.)。我们对两株真菌固体发酵产物进行分离纯化,以期找到具有生物活性的化合物。通过平板拮抗试验可知,菌株443固体发酵产物的石油醚相粗浸膏对油菜菌核病菌、番茄灰霉、辣椒疫霉、终极腐霉、小麦纹枯病菌有良好的拮抗效果,尤其对辣椒疫霉和番茄灰霉的抑制效果明显。通过菌株443对辣椒疫病的温室防效试验及对辣椒植株的促生试验,进一步验证了443的生物防治价值。然后,对菌株443进行形态学鉴定,结合ITS基因的测序结果鉴定该菌株为耙齿菌(Irpex sp.), NCBI中GenBank登录号为JF737033。菌株443采用以小麦麸皮作为基质的固体发酵,发酵物用(1：1,ⅴ：ⅴ)的氯仿和甲醇混合液充分萃取,减压蒸干得到粗浸膏,然后用水将粗浸膏重悬浮,用石油醚萃取。取石油醚相粗提物10g采用硅胶柱(200 g,200-300目)进行初步分离,以丙酮：石油醚的混合溶液为洗脱液,按0：100→1：100→5：100→10：100→20：100→40：100→80：100→100：0进行梯度洗脱,得到8个组分,各组分再经柱层析、薄层层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、重结晶等方法进行进一步分离纯化,得到六种化合物(化合物1-6)。通过高分辨质谱(HR-ESI-MS)、质谱(ESI-MS)、核磁共振(1H-NMR,13C-NMR, DEPT, 13C-1H-HSQC, 13C1H-HMBC,1H-1H COSY)等方法鉴定六种化合物为甾醇类化合物或脑苷脂类化合物。化合物1-5从耙齿菌443中分离的到,分别为麦角甾醇、胆甾醇、麦角甾-7,22(E)-二烯-3β,5α,6β-三醇(又称酵母甾醇)、(2S,2’R,3R,3E’,4E,8E)-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-2-N-(2’-羟基-十八-3’-烯基)-3-羟基-9-甲基-鞘氨-4,8-二烯醇(又称脑苷脂C)、(2S,2’R,3R,3E’,4E,8E)-1-O-β-D-吡喃葡萄糖基-2-N-(2’-羟基-十八-烷基)-3-羟基-9-甲基-鞘氨-4,8-二烯醇(又称脑苷脂D)。化合物6是从拟茎点霉By254中分离得到的,通过与已经分离得到的酵母甾醇的1H-NMR图谱进行比较,发现其特征峰一致,又经过HPLC检测分析,确定为酵母甾醇。本文首次从耙齿菌中分离出麦角甾醇、胆甾醇、酵母甾醇、脑苷脂C、脑苷脂D。并首次从拟茎点霉中分离得到酵母甾醇。虽然脑苷脂C、脑苷脂D对植物病原细菌仅有微弱的抑菌效果,但它们作为一种激发子,能够显著的激发植物对病原物的抵抗,在一定程度上降低病害的发生,这些具有生物活性的物质为生物源农药的开发与研制奠定了一定的基础。

全文目录

摘要 8-10ABSTRACT 10-12符号及缩略语 12-13第一部分文献综述 13-23 第一章耙齿菌及其次生代谢产物 13-17 1 耙齿菌的研究概述 13-14 2 脑苷脂类化合物的概念及生物活性 14-16 3 甾体化合物概述 16-17 第二章拟茎点霉及其次生代谢产物 17-23 1 植物内生真菌及其次生代谢产物概述 17-20 1.1 植物内生真菌简介 17 1.2 植物内生真菌次生代谢产物的开发和利用 17-20 2 拟茎点霉的次生代谢产物研究 20-23 2.1 拟茎点霉简介 20-21 2.2 拟茎点霉的次生代谢产物 21-23第二部分研究内容 23-51 第三章菌株443的生防特性及其鉴定 23-33 1 材料和方法 23-28 1.1 菌株来源 23 1.2 常用培养基 23-24 1.3 菌株443的固体发酵 24 1.4 菌株443发酵产物对病原真菌的拮抗试验 24 1.5 菌株443对辣椒疫病的温室防效及对辣椒的促生试验 24-26 1.5.1 菌株443孢子悬浮液的制备 24 1.5.2 菌株443发酵上清液的制备 24-25 1.5.3 辣椒疫霉孢子悬浮液的制备 25 1.5.4 辣椒幼苗的选育 25-26 1.6 数据统计与分析 26 1.7 菌株443的形态学鉴定 26 1.8 菌株443的分子生物学鉴定 26-28 1.8.1 真菌基因组DNA的提取 26 1.8.2 ITS通用引物扩增 26-27 1.8.3 PCR产物电泳 27 1.8.4 产物纯化及连接转化 27-28 1.8.5 ITS序歹IJ比对分析 28 2 结果及分析 28-30 2.1 菌株443发酵产物对病原真菌的拮抗 28-29 2.2 菌株443对辣椒疫病的温室防效试验 29 2.3 菌株443对辣椒的温室促生试验 29 2.4 菌株443的菌落形态 29-30 2.5 菌株443的分子生物学鉴定结果 30 3 小结与讨论 30-33 第四章耙齿菌443活性次生代谢产物的分离与鉴定 33-45 1 材料与方法 33-36 1.1 所用菌株来源 33 1.2 常用培养基 33 1.3 菌株443的固体发酵 33-34 1.4 菌株443固体发酵产物的分离 34-35 1.4.1 薄层层析(TLC) 34 1.4.2 硅胶柱层析 34-35 1.4.3 Sephadex LH-20凝胶柱层析 35 1.4.4 高效液相色谱 35 1.5 菌株443发酵产物的鉴定 35-36 1.5.1 质谱分析(MS) 35 1.5.2 核磁共振测定(NMR) 35-36 1.6 菌株443发酵产物的抑菌活性测定 36 1.7 菌株443分离产物对病原真菌的IC_(50)测定 36 2 结果及分析 36-43 2.1 菌株443的鉴定 36 2.2 菌株443的固体发酵产物 36 2.3 菌株443的固体发酵产物的分离纯化 36-38 2.4 分离产物的理化性质和结构鉴定 38-43 2.5 分离产物的抑菌活性测定 43 3 小结与讨论 43-45 第五章拟茎点霉BY254活性次生代谢产物的分离与鉴定 45-51 1 材料及方法 45-46 1.1 菌株来源 45 1.2 常用培养基 45 1.3 菌株By254的固体发酵 45 1.4 发酵产物的除盐除蜡 45-46 1.5 菌株By254发酵产物的分离 46 1.6 菌株By254分离产物的抑菌活性测定 46 1.7 菌株By254分离产物对病原真菌的IC_(50)测定 46 2 结果及分析 46-49 2.1 菌株By254发酵产物的分离纯化 46-47 2.2 分离化合物的理化性质和结构鉴定 47-48 2.3 化合物6对病原真菌的抑菌活性测定 48-49 3 小结与讨论 49-51参考文献 51-59附录一 443的ITS序列测定结果 59-61附录二化合物1-6的波谱数据 61-75攻读硕士期间发表文章 75-77致谢 77

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