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灰黄霉素产生菌FS80的诱变与选育研究

作　者: 张剑清
导　师: 毛宁
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 诱变 激光 灰黄霉素 效价 发酵
分类号: TQ927
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


以灰黄霉素产生菌—(Penicillium patulum)FS80-1为出发菌株,采用UV-LiCl进行复合诱变,经过三轮选育获得高产突变株GM120-43,经重氮盐显色法检测,其产灰黄霉素能力达到89496μg/g,与出发菌株FS80-1相比提高了80.04%,遗传稳定性良好。以UV-LiCl复合诱变获得的突变株GM120-43为出发菌株,采用半导体激光和CO2激光进行诱变,分别获得突变株LD100-1和C1448-1。突变株LD100-1经遗传稳定试验后,产灰黄霉素的效价达到119766μg/g,比出发菌株GM120-43提高了22.58%。由C02激光诱变获得的突变株C1448-1经遗传稳定性试验后,产灰黄霉素的效价低于出发菌株GM120-43。对突变株LD100-1进行固体培养条件研究,结果表明最佳培养条件如下：碳源基质为晚籼米；氮源为NaN03；培养基固形物的料水比以1：0.75为宜；灰黄霉素合成的前体氯化物以单加NaCl为宜,且Cl-浓度为0.188 mo1/L是较适宜的；采用液体液体种子液接种,菌龄以44 h,接种量为10%为宜。通过培养条件优化之后,LD100-1产灰黄霉素效价达162233μg/g,比未优化之前提高了39.16%。将出发菌株FS80-1及突变株GM120-43、LD100-1的大米孢子培养物用无水乙醇进行提取。采用HPLC对提取液中灰黄霉素含量进行检测,比较HPLC和重氮盐显色法两种检测方法的差异性,检测结果表明：菌株FS80-1、GM120-43和LD100-1产灰黄霉素能力分别为43511μg/g、91858μg/g和105423μg/g,HPLC的检测结果比重氮盐显色法检测结果稍微偏低。提取突变株GM120-43、LD100-1和出发菌株FS80-1的基因组DNA,并以其基因组DNA为模板,利用18S通用引物进行PCR扩增,将扩增到的18S rDNA测序并比对,发现突变株GM120-43和LD100-1两者之间的序列差异性很小,只是个别碱基不同,而与FS80-1相比有多处碱基存在差异,其中有三个区域序列差异性较大。对出发菌株FS80-1及突变株GM120-43、LD100-1液体发酵中装液量以及α-淀粉酶酶活进行研究,结果发现灰黄霉素产生菌——展青霉对氧气的需求量很大,250mL三角瓶装30 mL的发酵液为宜。同时检测发现,突变株GM120-43在发酵3d时,产α-淀粉酶酶活力最高,酶活力可达到82.3 u/mL。发酵结束后,镜检发现,相对出发菌株FS80-1和突变株LD100-1而言,突变株GM120-43产分生孢子量教少,发酵产灰黄霉素效价比出发菌株FS80-1及突变株LD100-1高。

全文目录


中文摘要  2-4Abstract  4-6中文文摘  6-8目录  8-11绪论  11-27  1.1 灰黄霉素的概述  11-16    1.1.1 灰黄霉素的化学结构及理化性质  11-12    1.1.2 灰黄霉素抗菌谱及作用机理  12    1.1.3 灰黄霉素的生物合成  12-16  1.2 微生物诱变育种简介  16-23    1.2.1 物理方法  17-20    1.2.2 化学方法  20-22    1.2.3 复合因子诱变方法  22-23  1.3 我国灰黄霉素研究进展  23-25    1.3.1 灰黄霉素高产菌株选育  23-24    1.3.2 灰黄霉素耐氯特性研究  24-25  1.4 本课题研究的目的及意义  25-27第一章 灰黄霉素高产菌株的选育  27-41  1.1 前言  27  1.2 材料和方法  27-32    1.2.1 菌株  27-28    1.2.2 培养基  28    1.2.3 主要仪器设备  28    1.2.4 主要试剂及配制  28-29    1.2.5 实验方法  29-32  1.3 结果与分析  32-38    1.3.1 灰黄霉素标准曲线  32    1.3.2 UV-LiCl复合诱变  32-34    1.3.3 半导体激光诱变  34-35    1.3.4 CO_2激光诱变  35-37    1.3.5 突变株稳定性遗传分析  37-38    1.3.6 诱变图谱  38  1.4 小结和讨论  38-41第二章 突变株LD100-1固态培养条件研究  41-51  2.1 前言  41  2.2 材料和方法  41-44    2.2.1 菌株  41    2.2.2 培养基  41-42    2.2.3 实验方法  42-44  2.3 结果与分析  44-50    2.3.1 碳源基质筛选  44    2.3.2 氮源试验结果  44-45    2.3.3 培养基料水比对菌株产灰黄霉素的影响  45-46    2.3.4 氯离子浓度对菌株产灰黄霉素的影响  46-47    2.3.5 种龄对菌株LD100-1产灰黄霉素的影响  47-49    2.3.6 接种量对菌株LD100-1产灰黄霉素的影响  49-50  2.4 小结和讨论  50-51第三章 HPLC检测灰黄霉素的初探  51-57  3.1 前言  51  3.2 试验仪器与材料  51-52    3.2.1 主要仪器  51    3.2.2 材料与试剂  51-52  3.3 试验方法  52-53    3.3.1 试验材料预处理  52    3.3.2 色谱条件  52    3.3.3 标准曲线的制作  52    3.3.4 大米孢子提取液的HPLC检测  52-53  3.4 结果与分析  53-56    3.4.1 灰黄霉素的标准曲线  53    3.4.2 灰黄霉素标准品的HPLC检测图谱  53-54    3.4.3 大米孢子提取液的HPLC检测  54-55    3.4.4 大米孢子提取液中灰黄霉素的比色法与HPLC检测比较  55-56  3.5 小结和讨论  56-57第四章 出发菌株FS80-1和突变株GM120-43、LD100-1的18S RDNA基因序列及发酵特性比较  57-75  4.1 前言  57  4.2 材料与方法  57-64    4.2.1 材料  57-59    4.2.2 实验方法  59-64  4.3 结果与分析  64-72    4.3.1 基因组DNA的获得  64    4.3.2 18S rDNA基因的获得  64-65    4.3.3 18S rDNA基因序列分析  65-68    4.3.4 出发菌株与突变株发酵特性比较  68-72  4.4 小结和讨论  72-75第五章 结论  75-77附录  77-79参考文献  79-85攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  85-87致谢  87-89个人简历  89-91

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制抗菌素
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