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Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达

作 者: 郭瑶
导 师: 陆兆新
学 校: 南京农业大学
专 业: 食品科学
关键词: 葡萄糖氧化酶 黑曲霉 毕赤酵母 发酵 性质
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase, GOD)系统命名为β-D-葡萄糖:氧化还原酶(EC1.1.3.4)。该酶能够利用氧气将葡萄糖氧化成葡萄糖酸并产生过氧化氢,因而具有除氧、抗氧化、去除葡萄糖以及生成葡萄糖酸的作用,被广泛应用于食品、医药、生物技术等行业。工业生产上多采用黑曲霉或青霉属的菌株发酵制备葡萄糖氧化酶,但是常出现酶活力不高、杂蛋白污染以及分离纯化繁琐等问题。因此,可通过基因工程技术构建葡萄糖氧化酶工程菌株,实现该酶的异源高效表达,同时简化纯化过程。本研究以实验室保藏的黑曲霉Aspergillus niger Z-25为出发菌株,克隆到葡萄糖氧化酶基因,并将该基因整合至毕赤酵母Pichia pastoris的染色体基因组上,实现了葡萄糖氧化酶的高效表达。同时,对重组毕赤酵母在摇瓶和发酵罐水平的产酶条件、重组葡萄糖氧化酶的纯化过程以及酶学性质进行了研究。主要内容如下:1.黑曲霉Z-25葡萄糖氧化酶基因的克隆与序列分析。以黑曲霉菌株Aspergillus niger Z-25的基因组DNA为模板,通过PCR扩增到1818 bp的葡萄糖氧化酶完整开放阅读框,在GenBank数据库中的登录号为FJ979866。序列分析表明,该葡萄糖氧化酶的核苷酸序列与A. niger NRRL-3和A. niger ATCC 9029的葡萄糖氧化酶核苷酸序列(登录号分别为X16061和J05242)相似性达93%,推导的氨基酸序列相似性达97%,共有17个氨基酸残基发生了置换。在编码A. niger Z-25葡萄糖氧化酶的氨基酸序列中,含有由22个氨基酸残基组成的信号肽和583个氨基酸残基组成的成熟肽,以及3个位于保守位点的半胱氨酸残基(Cys164、Cys206、Cys521)和7个潜在的N-糖基化位点Asn-X-Thr/Ser (Asn89、Asn161、Asnl68、Asn258、Asn355、Asn388、Asn473)。2.黑曲霉Z-25葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达。将A.niger Z-25葡萄糖氧化酶基因与毕赤酵母分泌型表达载体pPICZaA连接,构建重组表达载体pPICZaA-GOD。经限制性内切酶Pme I线性化后,电击转化毕赤酵母SMD1168,利用zeocin抗性梯度筛选、PCR鉴定,挑取6株重组酵母单菌落进行诱导培养。通过测定发酵上清液的酶活,最终筛选到一株高效表达葡萄糖氧化酶的重组酵母SMD1168/GOD.3.重组毕赤酵母在摇瓶和发酵罐水平的产酶条件研究。确定重组酵母SMD1168/GOD的摇瓶培养条件为:在YPG培养基中培养菌体至对数生长期(OD约为6.0)后,转入pH 5.0的BMMY培养基中,在30℃、240 rpm条件下诱导,每24 h添加甲醇至终浓度为2.0%。诱导168 h后,葡萄糖氧化酶的活力达40 U/mL左右,是出发菌株A. niger Z-25的20倍。在19 L发酵罐中高密度培养SMD1168/GOD时,控制温度29.5。C、培养基pH 5.5、溶氧25%以上,经过20.5 h的甘油分批阶段和7.5 h的甘油流加阶段后,开始甲醇流加培养。诱导142 h后,重组葡萄糖氧化酶的活力达522.5 U/mL,是摇瓶发酵水平的13倍。4.重组葡萄糖氧化酶的分离纯化和酶学性质研究。重组葡萄糖氧化酶粗酶液经60-90%饱和度的(NH4)2SO4沉淀后,得到电泳纯的葡萄糖氧化酶,比活力为153.46U/mg,回收率达到95.6%,纯化了3.34倍。经SDS-PAGE检测,重组葡萄糖氧化酶亚基的分子量约为94 kDa,糖基化程度为31.9%。重组葡萄糖氧化酶的最适作用温度和pH分别为40℃和6.0,在温度不超过40℃时能保持90%以上的酶活力,在pH值为4.0-8.0的范围内维持稳定。Ag+对重组葡萄糖氧化酶的活性具有明显的促进作用,Cu2+、Pb2+对重组酶的活性具有强烈的抑制作用,Fe3+对酶活有微弱的抑制作用。根据Lineweaver-Burk双倒数法计算得到重组葡萄糖氧化酶的Km和Kcat值分别为16.95mM和484.26 s-1。

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摘要  7-9ABSTRACT  9-11缩略词表  11-12表格索引  12-13图形索引  13-15第一章 文献综述  15-29  1 葡萄糖氧化酶研究进展  15-21    1.1 葡萄糖氧化酶简介  15-16    1.2 葡萄糖氧化酶的生产菌种  16    1.3 葡萄糖氧化酶活力的测定  16-17    1.4 葡萄糖氧化酶的应用  17-20      1.4.1 食品和饮料生产  17-18      1.4.2 酿酒类生产  18      1.4.3 葡萄糖酸的生产  18-19      1.4.4 口腔清洁  19      1.4.5 纺织品制造  19      1.4.6 生物传感器  19      1.4.7 生物燃料电池  19-20    1.5 葡萄糖氧化酶的分子生物学研究进展  20-21  2 巴斯德毕赤酵母表达系统  21-26    2.1 毕赤酵母表达宿主菌  22-23    2.2 毕赤酵母表达载体  23-24    2.3 影响外源蛋白表达的主要因素  24-26      2.3.1 外源基因的特性  25      2.3.2 启动子的选择  25      2.3.3 信号肽的选择  25-26      2.3.4 蛋白酶的降解  26      2.3.5 发酵条件的影响  26  3 本研究的目的意义和内容  26-29第二章 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达  29-67  1 材料与方法  29-43    1.1 材料  29-32      1.1.1 菌株与质粒  29      1.1.2 主要工具酶与试剂  29      1.1.3 主要仪器和设备  29-30      1.1.4 培养基和主要试剂的配制  30-32        1.1.4.1 培养基  30-31        1.1.4.2 培养基贮存液  31        1.1.4.3 黑曲霉和酵母基因组DNA提取的相关试剂  31        1.1.4.4 碱裂解法提取质粒的相关试剂  31-32        1.1.4.5 电击转化毕赤酵母的相关试剂  32        1.1.4.6 葡萄糖氧化酶活性测定的相关溶液  32    1.2 方法  32-43      1.2.1 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因的克隆与序列分析  32-35        1.2.1.1 Aspergillus niger Z-25基因组DNA的提取  32-33        1.2.1.2 引物设计与PCR扩增  33        1.2.1.3 PCR产物的纯化及其与pMD19-T载体的连接  33        1.2.1.4 大肠杆菌感受态制备和连接产物的转化  33-34        1.2.1.5 阳性克隆的筛选与重组质粒的提取  34-35        1.2.1.6 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因的序列分析  35      1.2.2 分泌型表达载体pPICZαA-GOD的构建  35-37        1.2.2.1 引物设计与PCR扩增  35        1.2.2.2 PCR产物和表达载体pPICZαA的双酶切  35-36        1.2.2.3 葡萄糖氧化酶基因与表达载体pPICZαA的连接以及连接产物的转化  36        1.2.2.4 阳性克隆的筛选与鉴定  36-37        1.2.2.5 重组质粒pPICZαA-GOD的测序  37      1.2.3 重组表达载体pPICZαA-GOD电击转化毕赤酵母SMD1168  37-38        1.2.3.1 重组质粒pPICZaA-GOD的大量提取与线性化  37        1.2.3.2 毕赤酵母感受态细胞的制备  37-38        1.2.3.3 重组质粒pPICZαA-GOD的电击转化  38      1.2.4 多拷贝转化子的筛选与鉴定  38-39        1.2.4.1 酵母转化子的zeocin抗性筛选  38        1.2.4.2 酵母基因组DNA的提取  38        1.2.4.3 酵母转化子的PCR鉴定  38-39      1.2.5 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的诱导表达  39-40        1.2.5.1 重组葡萄糖氧化酶的诱导表达  39        1.2.5.2 葡萄糖氧化酶的活力测定  39        1.2.5.3 SDS-PAGE检测  39        1.2.5.4 蛋白含量测定  39-40      1.2.6 重组毕赤酵母产葡萄糖氧化酶的发酵条件研究  40-41        1.2.6.1 摇瓶发酵产酶条件的研究  40-41        1.2.6.2 发酵罐高密度培养条件的研究  41      1.2.7 重组葡萄糖氧化酶的纯化以及酶学性质的研究  41-43        1.2.7.1 重组葡萄糖氧化酶的粗酶液制备  41        1.2.7.2 重组葡萄糖氧化酶的分离纯化  41-42        1.2.7.3 重组葡萄糖氧化酶最适反应温度和温度稳定性的测定  42        1.2.7.4 重组葡萄糖氧化酶最适作用pH和pH稳定性的测定  42        1.2.7.5 金属离子对重组葡萄糖氧化酶活性的影响  42        1.2.7.6 重组葡萄糖氧化酶动力学参数的测定  42-43  2 结果与分析  43-61    2.1 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因的克隆与序列分析  43-46      2.1.1 Aspergillus niger Z-25基因组DNA的提取  43      2.1.2 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因的克隆  43-45      2.1.3 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因的序列分析  45-46    2.2 分泌型表达载体pPICZαA-GOD的构建  46-49      2.2.1 葡萄糖氧化酶基因的PCR扩增  46-47      2.2.2 重组表达载体pPICZαA-GOD的构建与鉴定  47-49    2.3 表达载体pPICZαA-GOD电击转化毕赤酵母和酵母转化子的筛选  49-52      2.3.1 重组表达载体pPICZαA-GOD的线性化  49-50      2.3.2 酵母转化子的zeocin抗性筛选  50-51      2.3.3 酵母转化子的PCR鉴定  51-52    2.4 Aspergillus niger Z-25葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的表达  52-55      2.4.1 重组毕赤酵母菌株表达葡萄糖氧化酶的活力曲线测定  52-53      2.4.2 重组毕赤酵母产葡萄糖氧化酶的摇瓶发酵条件研究  53-55      2.4.3 发酵罐高密度培养条件的研究  55    2.5 重组葡萄糖氧化酶的纯化以及酶学性质的研究  55-61      2.5.1 重组葡萄糖氧化酶的分离纯化和分子量的测定  55-58      2.5.2 温度对重组葡萄糖氧化酶活性和稳定性的影响  58      2.5.3 pH对重组葡萄糖氧化酶活性和稳定性的影响  58-59      2.5.4 金属离子对重组葡萄糖氧化酶活性的影响  59-60      2.5.5 重组葡萄糖氧化酶的动力学参数测定  60      2.5.6 重组酶与天然酶的性质比较  60-61  3 讨论  61-66    3.1 毕赤酵母感受态细胞的制备和电击转化  61-62    3.2 多拷贝转化子的筛选与鉴定  62    3.3 信号肽的选择  62-63    3.4 重组毕赤酵母产葡萄糖氧化酶的发酵条件  63-64    3.5 重组葡萄糖氧化酶的分离纯化  64    3.6 不同来源的葡萄糖氧化酶的性质比较  64-65    3.7 进一步提高重组葡萄糖氧化酶活力的方法  65-66  4 结论  66-67参考文献  67-75研究生期间发表的研究论文  75-77致谢  77

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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