学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

酵母双杂交系统筛选与禽流感病毒NS1相互作用的宿主因子

作　者: 李丽
导　师: 常城
学　校: 兰州大学
专　业: 动物学
关键词: 禽流感病毒非结构蛋白宿主因子酵母双杂交
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 187次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

禽流感病毒非结构蛋白1(NS1蛋白)全长约为230个氨基酸,理论分子量约为26KDa,主要包括两个功能结构域,即N-末端的RNA结合结构域和和C-末端的效应结构域。NS1蛋白是一个多功能的病毒蛋白,它不仅影响着该病毒其他基因的表达,更能通过与宿主多种细胞因子的相互作用干预宿主细胞的正常功能,抵抗宿主的抗病毒系统。NS1蛋白因此被认为是禽流感病毒的一个重要毒力因子。为了寻找与NS1相互作用的其它宿主蛋白以及试图探索NS1的新功能,最终阐明禽流感的致病性机制,我们利用酵母双杂交系统,以NS1为诱饵蛋白,从人胸腺cDNA文库中筛到了8个宿主因子可与NS1蛋白相互作用,我们选择U蛋白作为我们研究的目的蛋白,并作了点对点酵母双杂交回转实验。结果发现两者确实是互作的,并且互作的部位位于NS1蛋白的RNA结合结构域上。同时我们利用GST Pull-down进一步验证了二者的相互作用。在研究当中还发现,高致病性禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白的80-84位氨基酸缺失可能对禽流感的致病性很重要,这提示针对H5N1型高致病性禽流感病毒可能是一个新的药物靶点。

全文目录

中文摘要  7-8
英文摘要  8-9
引言  9-11
  1 研究的目的和意义  9
  2 主要研究内容  9
  3 研究技术路线  9-11
第一章论文综述  11-24
  1.1 禽流感病毒研究进展  11-15
    1.1.1 禽流感病毒的形态和化学成分  11
    1.1.2 禽流感病毒的分子结构与分类  11-13
    1.1.3 禽流感病毒的复制与致病机理  13-14
    1.1.4 存在问题与展望  14-15
  1.2 NS1蛋白的结构  15-17
    1.2.1 N-末端RNA结合区的结构  15-16
    1.2.2 C-末端效应区的结构  16-17
  1.3 NS1蛋白的功能  17-20
    1.3.1 抑制和利用宿主细胞的转录翻译系统  17-18
    1.3.2 拮抗干扰素的抗病毒作用  18-19
    1.3.3 NS1蛋白下调细胞凋亡  19-20
  1.4 NS1蛋白与其他宿主蛋白相互作用  20
    1.4.1 NS1蛋白和importina/β相互作用  20
    1.4.2 NS1蛋白和nucleolin相互作用  20
  1.5 酵母双杂交系统  20-24
    1.5.1 酵母双杂交系统的作用原理  20-21
    1.5.2 酵母双杂交系统选用酵母作为报告株的优点  21-22
    1.5.3 酵母双杂交系统相对其他方法具有的优点  22
    1.5.4 酵母双杂交系统中常见的问题  22-24
第二章材料与方法  24-36
  2.1 材料  24-29
    2.1.1 菌株及细胞系  24
    2.1.2 质粒载体  24-25
    2.1.3 引物  25
    2.1.4 酶类、分子量标准与试剂盒  25
    2.1.5 主要化学试剂及常规溶液的配制  25-29
  2.2 方法  29-36
    2.2.1 PCR扩增  29-30
    2.2.2 DNA片段的回收(DNA片段凝胶回收试剂盒)  30
    2.2.3 限制性内切酶酶切反应  30-31
    2.2.4 酶切DNA片段与酶切载体的连接  31
    2.2.5 感受态细胞的制备(RbCI法)  31
    2.2.6 RbC1感受态细胞的转化  31
    2.2.7 质粒快速抽提(质粒小量纯化试剂盒)  31-32
    2.2.8 酵母感受态的制备与转化  32
    2.2.9 酵母蛋白的提取  32-33
    2.2.10 酵母质粒的提取  33
    2.2.11 酵母转化子β-半乳糖苷酶的固体测活  33-34
    2.2.12 细胞培养及转染  34
    2.2.13 Western Blotting  34-35
    2.2.14 融合蛋白的原核表达与纯化  35
    2.2.15 GST Pull Down分析  35-36
第三章实验结果  36-42
  3.1 pGBKT7-NS1重组质粒的构建  36
    3.1.1 PCR扩增禽流感病毒NS1基因  36
    3.1.2 pGBKT7-NS1酵母表达载体的构建  36
  3.2 酵母双杂交系统筛选与NS1相互作用的宿主蛋白  36-40
    3.2.1 pGBKT7-NS1在酵母AH109中蛋白表达的检测  36-37
    3.2.2 pGBKT7-NS1自激活活性的检测  37
    3.2.3 cDNA文库转化酵母AH109  37-38
    3.2.4 阳性克隆的筛选  38
    3.2.5 提取酵母质粒进行PCR扩增并转化大肠杆菌  38
    3.2.6 测序结果与分析  38
    3.2.7 回交验证  38-40
  3.3 GST Pull-down验证NS1蛋白与文库蛋白的相互作用  40-42
    3.3.1 PCR扩增文库蛋白基因  40
    3.3.2 pGEX4T1-U原核表达载体的构建  40
    3.3.3 U蛋白在原核细胞中的表达  40
    3.3.4 GST Pull-down实验  40-42
第四章讨论  42-44
  4.1 酵母双杂交系统  42-43
  4.2 蛋白相互作用的鉴定  43
  4.3 NS1蛋白功能提示  43-44
参考文献  44-47
硕士期间发表文章  47-48
致谢  48-49
附录  49

酵母双杂交系统筛选与禽流感病毒NS1相互作用的宿主因子

内容摘要

全文目录

相似论文