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PCV2兰州分离株ORF2片段的序列分析与原核表达

作　者: 傅昱
导　师: 胡永浩；刘在新；卢曾军
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: PCV PMWS 分离鉴定 ORF2 克隆 表达
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 47次
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内容摘要


猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、母猪繁殖障碍(sow abortion and mortality syndrome,SAMS)、猪皮肤肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)和呼吸道综合征等相关疾病的重要病原[1] [2]。由于PCV2病毒感染的个体同时可以检测出PCV1病毒,区别PCV1和PCV2是正确诊断断奶仔猪多系统衰竭综合症等临床疾病的基础。PCV2是一种免疫抑制性病毒,损害感染猪的免疫功能,引起继发感染或者合并感染。PCV病毒ORF2阅读框的保守性很高,PCV1和PCV2的ORF2阅读框的同源性只有67%左右。本试验设计了一对PCV1和PCV2共用引物,从兰州地区猪场采集症状疑似PMWS仔猪的肺脏、淋巴结等病料,经处理后接种无PCV污染的PK-15细胞,增殖病毒并提取病毒核酸,用PCR等方法得到PCV病毒ORF2序列片段,进行测序。结果表明,兰州地区已存在PCV病毒的感染。所得PCV病毒ORF2序列与GenBank的PCV1和PCV2型ORF2阅读框的8个序列进行同源性分析,兰州地区分离株的ORF2阅读框核苷酸与PCV2病毒ORF2阅读框的同源性达到99%,与PCV1同源性为68%,证实兰州地区分离株为PCV2。根据分离毒株基因测序结果和GenBank中PCV2的ORF2片段序列,利用DNAStar分析软件对所得基因片段进行改造和优化,得到约700bp的合成片段;利用表达载体pET-32a进行目的基因片段克隆,阳性重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;纯化后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明,合成基因片段在大肠杆菌中表达的重合蛋白相对分子量约为50KDa,Western blotting分析证实,该重合蛋白能被PCV2阳性血清识别。

全文目录


中文摘要  2-4
Summary  4-5
缩略语  5-9
第一部分 文献综述  9-31
  第一章 猪圆环病毒感染及相关疾病  9-21
    1 猪圆环病毒感染及危害  9
    2 猪圆环病毒病流行状况和分布  9-11
      2.1 猪圆环病毒病在世界上的流行分布  9-11
      2.2 我国猪圆环病毒病的流行分布  11
    3 猪圆环病毒病致病机理  11-15
      3.1 猪圆环病毒感染途径  11-12
      3.2 致病机制  12-14
      3.3 PCV 对淋巴细胞的影响  14-15
      3.4 PCV 对细胞因子的影响  15
    4 临床症状和病理变化  15-16
    5 与PCV2 感染相关的疾病  16-18
      5.1 断奶仔猪多系统衰竭综合症  16-17
      5.2 猪皮炎肾病综合征  17
      5.3 猪繁殖障碍  17
      5.4 猪A2 型先天性震颤  17-18
      5.5 猪呼吸道病复合征  18
      5.6 猪增生性和坏死性肺炎  18
    6 猪圆环病毒疫苗研究进展  18-20
    7 猪圆环病毒病防治策略  20-21
  第二章 猪圆环病毒研究进展  21-31
    1 猪圆环病毒的发现与命名  21
    2 猪圆环病毒的分类地位  21-22
    3 猪圆环病毒的形态学特征  22-23
    4 猪圆环病毒的物理化学特性  23
    5 猪圆环病毒培养特性  23
    6 猪圆环病毒的分子生物学特征  23-28
      6.1 猪圆环病毒的基因组学特点  23-25
      6.2 猪圆环病毒的复制与转录  25-26
      6.3 主要ORFs 及其编码蛋白  26-28
        6.3.1 主要的ORFs  26
        6.3.2 Rep 蛋白  26-27
        6.3.3 Cap 蛋白  27-28
    7 猪圆环病毒的检测技术  28-31
      7.1 猪圆环病毒抗原的检测方法  28-29
        7.1.1 病毒的分离及其电镜观察  28
        7.1.2 PCR 检测技术  28-29
        7.1.3 免疫组织化学试验  29
        7.1.4 核酸探针及其原位杂交技术  29
      7.2 猪圆环病毒抗体检测技术  29-31
        7.2.1 间接免疫荧光技术  29-30
        7.2.2 酶联免疫吸附试验  30
        7.2.3 免疫过氧化物酶单层细胞试验  30-31
第二部分 试验研究  31-64
  第三章 PCV2兰州分离株ORF2片段的序列 分析  31-47
    1 材料  31-34
      1.1 病料  31
      1.2 细胞与菌株  31-32
      1.3 共用引物  32
      1.4 主要试剂  32
      1.5 溶液配制  32-34
        1.5.1 DNA 提取所用试剂及溶液  32
        1.5.2 琼脂糖凝胶电泳所用试剂及溶液  32-33
        1.5.3 病毒分离培养所需试剂及培养基  33
        1.5.4 细菌培养和重组质粒筛选主要用试剂及培养基  33-34
      1.6 主要实验仪器  34
    2 方法  34-39
      2.1 PK-15 细胞的复苏  34
      2.2 病料细胞毒的提取  34-35
      2.3 病毒的培养  35
      2.4 引物设计与合成  35
      2.5 病毒总DNA 的提取  35-36
      2.6 基因组特定片段PCR 扩增反应  36
      2.7 电泳检测  36
      2.8 PCR 产物的回收  36-37
      2.9 回收后的PCR 产物与pGEM-T Easy 载体的连接  37
      2.10 感受态细胞的转化  37-38
      2.11 小量重组质粒DNA 的提取和双酶切鉴定  38-39
      2.12 序列测定  39
      2.13 9 株分离株ORF2 序列特性分析  39
    3 结果  39-44
      3.1 病毒培养  39
      3.2 细胞收获毒的PCR 检测  39-40
      3.3 重组质粒的鉴定  40
      3.4 测序结果  40-41
      3.5 本地样品PCV 的ORF2 序列同源性及系统进化分析  41-44
    4 分析与讨论  44-47
  第四章 猪圆环病毒2 型ORF2 基因片段的原核表达  47-64
    1 材料  47-50
      1.1 目的片段  47
      1.2 载体与菌株  47-48
      1.3 血清  48
      1.4 主要试剂  48
      1.5 溶液配制  48-50
        1.5.1 SDS-PAGE 所用试剂及溶液  48-49
        1.5.2 Westemblotting 试剂配置  49
        1.5.3 X-gal 溶液(20mg/mL)  49
        1.5.4 IPTG(20%,m/v)  49
        1.5.5 纯化试剂配制  49-50
      1.6 仪器  50
    2 方法  50-55
      2.1 ORF2 基因片段的优化合成  50
      2.2 对合成的pUC-ORF2 目的片段鉴定  50-51
      2.3 ORF2-pET 32a 重组质粒的构建和鉴定  51-52
      2.4 ORF2-pET 32a 重组质粒转入BL21 感受态细胞和酶切鉴定  52
      2.5 诱导表达  52
      2.6 SDS-PAGE 分析  52-53
      2.7 融合表达产物的可溶性分析  53
      2.8 重组融合蛋白的纯化及浓度测定  53-54
        2.8.1 诱导后细胞液的处理，即细胞裂解液的准备  53
        2.8.2 纯化柱的准备  53-54
        2.8.3 纯化过程  54
        2.8.4 纯化后蛋白浓度测定  54
      2.9 纯化产物的Western blotting  54-55
        2.9.1 纯化产物的SDS-PAGE 凝胶制备  54
        2.9.2 Western blotting  54-55
    3 结果  55-61
      3.1 ORF2 基因片段的优化合成  55
      3.2 合成的pUC-ORF2 目的片段鉴定  55-56
      3.3 ORF2-pET 32a 载体质粒的构建和鉴定  56-57
      3.4 ORF2-pET 32a 重组质粒转入BL21 感受态细胞和酶切鉴定  57-58
      3.5 ORF2-pET 32a 基因的诱导表达和SDS-PAGE 分析  58
      3.6 融合表达产物的可溶性分析  58-59
      3.7 重组融合蛋白的纯化及浓度测定  59-60
      3.8 纯化产物的 Western blotting  60-61
    4 分析与讨论  61-64
      4.1 对片段的优化合成  61
      4.2 pET32a 载体的选择  61-62
      4.3 宿主细胞的选择  62
      4.4 纯化和Western blotting  62-64
参考文献  64-70
致谢  70-71
导师简介  71-72
作者简介  72-74

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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