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猪圆环病毒Ⅱ型新疆株的分离鉴定及ORF2基因的原核表达

作　者: 张伟
导　师: 冉多良
学　校: 新疆农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪圆环病毒Ⅱ型分离鉴定 ORF2基因原核表达
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本研究通过从昌吉周边规模化猪场采集疑似PMWS病料,将样品经研磨、冻融、过滤等处理后,接种于PK15细胞,盲传6代。根据GenBank中猪圆环病毒基因组序列,设计两对PCV特异性引物,从病毒液中提取病毒核酸,应用PCR方法扩增含有EcoRⅠ酶切位点的PCV2特异性片段,酶切鉴定后证实采集的病料中有PCV2存在。将盲传6代细胞病毒经免疫荧光试验检测,可见细胞的胞质中含PCV特有的免疫荧光,表明该猪场中已存在PCV2感染。用扩增PCV2全基因组的特异性引物P2-1/P2-2,扩增病毒全基因组序列,回收PCR扩增产物,克隆到pMD18-T载体中,经PCR、酶切鉴定以及序列测定后,最终获得2个阳性克隆株,分别命名为XJPCV2-a株和XJPCV2-b株。通过多序列比对和遗传进化树分析,表明2个分离株全基因组序列与国内外其它16个PCV2毒株之间,核苷酸同源性分别为95.8%-99.4%；而与2个PCV1参考毒株之间核苷酸的同源性则仅为75.9%-76.1%,2个分离株之间核苷酸同源性高达99.3%。遗传进化树分析证实了本试验分离株与GenBank中登陆的16个PCV2毒株之间不存在地理位置上的相关性。2个毒株的成功分离为本地区规模化养猪场有效地诊断防治猪圆环病毒提供了科学依据,丰富了新疆地区规模化猪场PCV2感染的流行病学资料。根据分离株XJPCV2基因组序列,设计一对引物,以重组质粒pMD18-PCV2-a为模板,扩增出大小为654bp的ORF2基因片段。通过对ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列进行分析可知,ORF2编码的蛋白在其氨基端含有许多稀有密码子,稀有密码子的存在影响到ORF2基因的表达,并且该蛋白的抗原位点主要位于羧基端。因此,通过限制性酶切对ORF2基因进行修饰,最终获得393 bp的ORF2基因。将截短的ORF2基因亚克隆到融合表达载体pGEX-6p-1中。经PCR、酶切鉴定以及序列分析后,将阳性重组子转入大肠杆菌BL21(DE3)中,进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳和Western blotting分析结果表明,重组质粒在大肠杆菌中表达的融合蛋白相对分子量为40.7kDa,融合蛋白能被PCV2单克隆抗体所识别,说明该融合蛋白可作为一种诊断PCV2感染用的诊断抗原。融合蛋白成功表达为猪圆环病毒病的临床诊断、建立血清学诊断技术以及疫苗的研制奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
第1章猪圆环病毒研究进展  8-22
  1.1 猪圆环病毒的病原学特性  8-10
  1.2 猪圆环病毒的基因组结构与功能  10-13
  1.3 PCV2的致病机制  13-14
  1.4 猪圆环病毒的诊断方法  14-18
  1.5 猪圆环病毒的疫苗研究  18-20
  1.6 研究目的及意义  20-22
第2章猪圆环病毒Ⅱ型新疆株的分离与鉴定  22-28
  2.1 实验材料  22-23
  2.2 方法  23-25
  2.3 结果  25-26
  2.4 讨论  26-28
第3章猪圆环病毒Ⅱ型新疆分离株全基因组克隆与分析  28-39
  3.1 实验材料  28
  3.2 方法  28-31
  3.3 结果  31-37
  3.4 讨论  37-39
第4章猪圆环病毒Ⅱ型ORF2截短基因的原核表达  39-50
  4.1 实验材料  39
  4.2 方法  39-43
  4.3 结果  43-47
  4.4 讨论  47-50
第5章结论  50-51
参考文献  51-65
致谢  65-66
作者简介  66

猪圆环病毒Ⅱ型新疆株的分离鉴定及ORF2基因的原核表达

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