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链霉亲和素的原核表达及复性

作　者: 彭福中
导　师: 陈雪岚
学　校: 江西师范大学
专　业: 生物化工
关键词: 链霉亲和素枯草杆菌表达系统大肠杆菌表达系统克隆表达蛋白复性 ELISA 生物素-链霉亲和素
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

SA(streptavidin下称SA)是Streptomyces avidinii菌培养过程中外分泌的一种蛋白产物,可以高度特异性地结合水溶性的维生素,D-生物素(D-biotin)。SA-biotin系统具有亲和力高、特异性强、灵敏度高、稳定性好、信号放大等优点,SA-biotin系统广泛地运用于医学、免疫学、分子生物学及组织化学等相关领域。目前SA主要来源于链霉菌属的传统发酵和基因工程菌的外源表达,后者具有生产周期短、产量高、易于纯化等优点,成为近年来生产研究的热点。大肠杆菌表达系统与枯草杆菌表达系统是当前运用最为广泛的两种原核表达系统。前者具有过量表达外源蛋白、生产运用广泛、遗传及分子生物学背景清晰等优点,而后者具有可外分泌表达外源蛋白、安全可靠等优点。本论文运用枯草芽孢杆菌表达系统和大肠杆菌表达系统表达多种形式SA并对表达的蛋白进行复性,目的在于探索获得高产SA的表达菌株以及SA高效复性方案。本研究通过PCR扩增成功获得三种SA的编码基因:stv-13(编码16-133位氨基酸残基)、csa(编码13-139位氨基酸残基)、cnsa(编码13-159位氨基酸残基)。将stv-13克隆到B. subtilis表达载体pP43和pSacR中,构建B. subtilisWB800(pSacR-stv-13)蔗糖诱导型表达菌、B. subtilis WB800(pP43-stv-13)和B. subtilis168(pP43-stv-13)组成型表达菌株,但均无明显外分泌表达目的蛋白。将stv-13、csa、cnsa克隆到E. coli表达载体pET22b、pET11a中,构建成表达菌株BL21(DE3)(pET22b-stv-13)、BL21(DE3)(pET22b-csa)、BL21(DE3)(pET11a-cnsa)、BL21(DE3)pLysS(pET22b-stv-13)、BL21(DE3)pLysS(pET22b-csa)、BL21(DE3)pLysS(pET11a-cnsa)、ER2566(pET22b-stv-13)、ER2566(pET22b-csa)、ER2566(pET22b-cnsa),经IPTG诱导表达,结果显示BL21(DE3)pLysS(pET11a- cnsa)SA表达量最高。通过表达条件和复性条件的优化,SA表达量占菌体总蛋白的40%以上,其包涵体的复性效率在80%以上。复性后的SA经ELISA鉴定,结果显示其生物活性略低于商品化的标准SA。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-6
缩略语索引  6-12
第1章链霉亲和素（SA）及其应用的研究进展  12-24
  前言  12
  1.1 SA 蛋白简介  12-14
  1.2 SA 与生物素的结合机制  14-15
  1.3 SA 的外源表达  15-16
    1.3.1 SA 基因的研究  15
    1.3.2 SA 在大肠杆菌表达系统中的表达研究  15-16
    1.3.3 SA 在枯草杆菌表达系统中的表达研究  16
  1.4 SA 的应用  16-18
    1.4.1 BSA 系统的应用  16-18
      1.4.1.1 BSA 在生物技术中的应用  17
      1.4.1.2 BSA 在免疫荧光技术中的应用  17
      1.4.1.3 BSA 在免疫放射技术中的应用  17-18
      1.4.1.4 BSA 在胶体金技术中的应用  18
      1.4.1.5 BSA 在免疫酶技术及在ELISA 中的应用  18
      1.4.1.6 BSA 在组织化学中的应用  18
    1.4.2 SA 作为模式蛋白的应用  18
  1.5 展望  18-24
第2章核心链霉亲和素在枯草芽孢杆菌中的表达  24-44
  前言  24-25
  2.1 材料与试剂  25-26
    2.1.1 实验材料  25
    2.1.2 实验设备及试剂  25
    2.1.3 培养基配制  25
    2.1.4 试剂配制  25-26
      2.1.4.1 50×Tris-乙酸（TAE）  25
      2.1.4.2 2.096琼脂糖凝胶的配制  25-26
      2.1.4.3 SDS-PAGE 凝胶染色液  26
      2.1.4.4 SDS-PAGE 凝胶脱色液  26
      2.1.4.5 10×Tris-甘氨酸  26
      2.1.4.6 6×SDS 凝胶加样缓冲液  26
      2.1.4.7 枯草杆菌普通化学感受态细胞制备用试剂  26
  2.2 实验方法  26-36
    2.2.1 表达载体的选择  26
    2.2.2 枯草芽孢杆菌组成型外分泌表达载体的构建  26-32
      2.2.2.1 Streptomyces avidinii 基因组DNA 的提取  26
      2.2.2.2 引物设计及 PCR 扩增  26-28
      2.2.2.3 PCR 产物的纯化  28
      2.2.2.4 PCR 产物的加A 及TA 克隆  28-29
      2.2.2.5 转化  29-30
      2.2.2.6 质粒提取  30-31
      2.2.2.7 酶切及酶切产物的纯化  31
      2.2.2.8 连接  31-32
    2.2.3 枯草芽孢杆菌蔗糖诱导型外分泌载体的构建  32-34
      2.2.3.1 SacR 基因的PCR 扩增及回收纯化  32-33
      2.2.3.2 表达质粒载体pP43-stv-13 的提取  33
      2.2.3.3 sacR 基因和pP43-stv-13 质粒的酶切回收及连接  33-34
    2.2.4 组成型枯草芽孢杆菌外分泌表达 Stv-13 菌株的构建  34
      2.2.4.1 表达质粒载体pP43-stv13 的提取  34
      2.2.4.2 枯草芽孢杆菌 W8800 和168 的感受态的制备及转化  34
    2.2.5 枯草芽孢杆菌蔗糖诱导外分泌表达菌株的构建  34
    2.2.6 Stv-13 在枯草芽孢杆菌W8800 和168 中发酵分泌表达  34-35
      2.2.6.1 组成型宿主菌培养及发酵表达  34-35
      2.2.6.2 诱导型宿主菌培养及发酵表达  35
    2.2.7 SDS-PAGE 鉴定发酵上清  35
      2.2.7.1 聚丙烯酰胺凝胶的配制  35
      2.2.7.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳  35
    2.2.8 ELISA 鉴定发酵上清液  35-36
      2.2.8.1 HRP-biotin 的制备  35-36
      2.2.8.2 直接 ELISA 检测外分泌表达上清  36
  2.3 结果与讨论  36-43
    2.3.1 stv-13 基因的PCR 产物的回收、TA 克隆和pP43 酶切回收  36-37
    2.3.2 pP43-stv-13 枯草芽孢杆菌组成型外分泌表达载体的构建  37-38
    2.3.3 pP43-stv-13 表达载体转化枯草杆菌W8800 和168  38
    2.3.4 sacR 基因的PCR 扩增结果及psacR-stv-13 双酶切验证  38-39
    2.3.5 组成型枯草杆菌 WB800 和 168 发酵表达 Stv-13  39-40
    2.3.6 枯草杆菌 W8800(psacR-stv-13)蔗糖诱导发酵表达  40-41
    2.3.7 发酵上清液的直接 ELISA 法检测  41
    2.3.8 讨论  41-43
  参考文献  43-44
第3章链霉亲和素在大肠杆菌中的表达  44-60
  前言  44-45
  3.1 实验材料与试剂  45
    3.1.1 实验材料  45
    3.1.2 仪器设备及试剂  45
    3.1.3 培养基配制  45
      3.1.3.1 LB 培养基  45
      3.1.3.2 ATM 培养基  45
  3.2 实验方法  45-50
    3.2.3 表达载体的选择  45-46
    3.2.4 引物设计及 PCR 扩增  46-48
    3.2.5 表达宿主的构建  48
    3.2.6 目的蛋白的诱导表达  48
    3.2.7 表达菌体细胞的破碎  48-49
    3.2.8 表达条件的优化  49-50
      3.2.8.1 诱导温度对 CNSA 表达的影响  49
      3.2.8.2 IPTG 浓度对CNSA 表达的影响  49
      3.2.8.3 诱导时间对 CNSA 表达的影响  49
      3.2.8.4 葡萄糖浓度对 CNSA 表达的影响  49
      3.2.8.5 葡萄糖与诱导前培养物的孵育时间对 CNSA 表达的影响  49-50
  3.3 结果与讨论  50-58
    3.3.1 目的片段和载体酶切回收结果  50-51
    3.3.2 表达载体菌落 PCR 及双酶切验证  51
    3.3.3 SA 在宿主菌中的表达  51-53
    3.3.4 BL21（DE3）pLysS（pET11a-cnsa）表达条件的优化  53-57
      3.3.4.1 诱导温度对目的蛋白表达的影响  53-54
      3.3.4.2 IPTG 诱导浓度对目的蛋白表达的影响  54
      3.3.4.3 诱导时间对目的蛋白表达的影响  54-55
      3.3.4.4 葡萄糖浓度对目的蛋白表达的影响  55-56
      3.3.4.5 种子培养物与葡萄糖孵育时间对目的蛋白表达的影响  56-57
    3.3.5 讨论  57-58
  参考文献  58-60
第4章链霉亲和素包涵体的复性  60-70
  前言  60
  4.1 实验材料及器材  60-61
  4.2 实验方法  61-63
    4.2.1 SA 的诱导表达  61
    4.2.2 包涵体的收集  61
    4.2.3 8 M 尿素溶解包涵体沉淀  61
    4.2.4 复性初始液中蛋白含量的测定  61-62
      4.2.4.1 标准曲线绘制  61-62
      4.2.4.2 样品测定  62
    4.2.5 透析复性  62
      4.2.5.1 透析袋的处理  62
      4.2.5.2 透析与复性蛋白的回收  62
      4.2.5.3 SDS-PAGE 检测复性后的SA  62
    4.2.6 复性条件的优化  62-63
      4.2.6.1 复性温度的选择  62
      4.2.6.2 浓度梯度复性和直接复性的选择  62-63
      4.2.6.3 复性初始液蛋白浓度的选择  63
    4.2.7 ELISA 鉴定复性SA 蛋白的活性  63
      4.2.7.1 测定透析上清液的蛋白含量  63
      4.2.7.2 ELISA 测定复性SA 蛋白活性  63
  4.3 结果与讨论  63-69
    4.3.1 BSA 蛋白浓度标准曲线  63-64
    4.3.2 包涵体透析复性  64-65
    4.3.3 复性条件的优化  65-67
      4.3.3.1 复性温度的选择  65
      4.3.3.2 透析复性方式的选择  65-66
      4.3.3.3 复性蛋白浓度的选择  66-67
    4.3.4 ELISA 检测复性蛋白的生物活性  67-68
    4.3.5 讨论  68-69
  参考文献  69-70
第5章结论与展望  70-72
  5.1 结论  70
    5.1.1 SA 枯草芽孢杆菌表达系统和大肠杆菌表达系统的构建  70
    5.1.2 SA 诱导表达情况的分析及表达条件的优化  70
    5.1.3 表达的 SA 复性情况的分析及复性条件的优化  70
    5.1.4 SA 的生物活性研究  70
  5.2 展望  70-72
附录  72-82
  附录A1 仪器设备  72-73
  附录A2 试剂  73-75
  附录B1  75-77
  附录B2  77-79
  附录C DNA 测序结果  79-82
致谢  82-84
个人介绍  84
攻读学位期间的研究成果  84

链霉亲和素的原核表达及复性

内容摘要

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