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禽致病性大肠杆菌鸭源分离株侵袭相关基因致病机理研究

作 者: 师震宇
导 师: 陆承平;戴建君
学 校: 南京农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: APEC ibeB基因 yijP基因 PCR检测 克隆表达 缺失株构建与分析
分类号: S852.61
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


禽的大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli, APEC)引起的一种常见的细菌性疾病,对养禽业危害极大,同时具有公共卫生意义。新生儿脑膜炎大肠杆菌(Neonatal meningitis E. coli, NMEC)是导致新生儿脑膜炎主要病原菌之一,目前在NMEC的研究中,已确定ibeA、ibeB、yijP、aslA、ypdP和ompA等多个基因与其穿越血脑屏障有关。APEC和NMEC在基因组结构上很相似,且具有很多相同的毒力因子。侵袭并穿越血脑屏障是细菌导致脑膜炎的关键步骤,侵袭相关基因ibeB、yijP在APEC中广泛分布,显示其具有重要的公共卫生意义。根据已登陆GenBank的侵袭相关基因ibeB、yijP的序列,设计并合成两对引物,检测ibeB、yijP基因在100株不同来源、不同地区大肠杆菌中的分布,结果表明,所有菌株都含有ibeB、yijP基因。以APEC鸭源株DE205B株基因组为模板PCR扩增ibeB和yijP开放阅读框,连接pMD18-T载体后测序。将测序结果与GenBank中APEC O1、BL21(DE3)、CFT073、RS218、UT189、O157:H7菌株进行比对和进化树分析。结果显示,DE205B的ibeB、yijP基因与上述菌株有较高同源性,同源率在96.9%-100%之间。对不同菌株的ibeB和yijP基因进行进化树分析表明,DE205B与APEC O1、RS218、UT189同处于一个小进化分枝中,亲缘关系较近;与O157:H7、BL21(DE3)亲缘关系较远,与CFT073的亲缘关系介于前两个类群之间。将DE205B的ibeB和yijP基因全长序列定向克隆于经同样酶双酶切的pET-32a(+)中,转化表达宿主菌BL21 (DE3).经IPTG诱导可表达分子量约69.3kDa、83.4kDa的IbeB、YijP重组蛋白。超声破碎,裂解物作SDS-PAGE凝胶电泳,显示两个蛋白条带,均存在于包涵体。免疫转印结果显示,IbeB、YijP重组蛋白都能被DE205B全菌抗血清识别,表明二者具备免疫原性。蛋白经镍柱纯化、透析脱盐复性,分别免疫新西兰大白兔,获得效价较高的免疫血清。侵袭抑制试验证明,免疫血清能抑制DE205B对DF-1细胞的侵袭。为进一步研究ibeB基因的功能,利用Red重组系统构建DE205B ibeB基因缺失株及其互补株。对野生株、缺失株、互补株的生物学特性进行分析,结果显示,ibeB缺失株对小鼠及雏鸭的致病力低于野生株,且互补株的致病力高于缺失株,提示ibeB在APEC的致病过程中发挥一定作用。ibeB缺失株对DF-1细胞和脑组织的侵袭能力显著低于野生株(P<0.05),且互补株的侵袭能力显著高于缺失株(P<0.05),提示ibeB基因在APEC侵袭细胞并穿透血脑屏障过程中发挥一定作用。ibeB缺失株中ibeA基因的相对表达率低于野生株,且互补株中ibeB基因的相对表达率高于缺失株,提示ibeB基因可能通过调控ibeA基因的表达水平影响APEC的致病能力。

全文目录


摘要  8-10ABSTRACT  10-12第一篇 文献综述  12-44  第一章 禽致病性大肠杆菌的研究进展  12-32    1 病原学  12-13    2 流行病学  13-14    3 临床类型和病理变化  14    4 致病机理  14-15    5 大肠杆菌毒力因子  15-24      5.1 黏附素  15-17      5.2 摄铁系统  17-18      5.3 温度敏感性血凝素  18-19      5.4 抗血清存活因子  19-22      5.5 毒素(Toxin)  22-24    6 结束语  24-25    参考文献  25-32  第二章 大肠杆菌侵袭血脑屏障机理研究  32-44    1 血脑屏障的结构  32-33    2 大肠杆菌侵袭血脑屏障的过程  33-35      2.1 菌血症  33      2.2 大肠杆菌粘附于HBMEC  33-34      2.3 大肠杆菌侵袭血脑屏障  34      2.4 大肠杆菌引起的细胞骨架重排  34-35      2.5 大肠杆菌在穿越过程中保持活性  35    3 侵袭相关毒力因子  35-39      3.1 OmpA  36      3.2 K1荚膜  36-37      3.3 CNF1  37      3.4 Ibe蛋白  37-38      3.5 Ⅰ型菌毛  38      3.6 其他因子  38-39    4 结束语  39    参考文献  39-44第二篇 试验研究  44-90  第三章 侵袭相关基因ibeB、yijP在不同来源大肠杆菌中的分布及序列分析  44-56    摘要  44-45    1 材料与方法  45-47      1.1 菌株与质粒  45      1.2 主要试剂与仪器  45      1.3 菌株的培养  45      1.4 DNA的提取和PCR扩增  45-46      1.5 PCR产物的T/A连接  46      1.6 连接产物的转化  46-47      1.7 重组质粒的提取与酶切鉴定  47      1.8 测序及序列分析  47    2 结果  47-51      2.1 PCR检测  47-49      2.2 克隆载体pMD-T-ibeB、pMD-T-yijP的构建  49      2.3 序列分析  49-51    3 讨论  51-52    参考文献  52-54    ABSTRACT  54-56  第四章 APEC鸭源株DE205B侵袭相关基因ibeB、yijP的克隆表达  56-70    摘要  56-57    1 材料与方法  57-63      1.1 菌株与质粒  57      1.2 要试剂与仪器  57      1.3 实验动物  57      1.4 菌株的培养  57      1.5 表达菌株的构建与鉴定  57-59      1.6 重组蛋白的表达  59-61      1.7 兔抗DE205B全菌血清的制备  61      1.8 表达蛋白的纯化与复性  61      1.9 纯化蛋白抗血清的制备及多抗效价的测定  61-62      1.10 DE205B的侵袭抑制实验  62-63    2 结果  63-66      2.1 重组质粒的鉴定和蛋白的分析与鉴定  63-64      2.2 表达产物的鉴定与纯化  64-65      2.3 免疫血清效价的间接ELISA检测  65      2.4 侵袭抑制实验  65-66    3 讨论  66-67    参考文献  67-69    ABSTRACT  69-70  第五章 APEC鸭源株DE205B ibeB基因缺失株的构建及其特性分析  70-90    摘要  70-72    1 材料与方法  72-79      1.1 材料  72      1.2 ibeB基因上下游序列的测定  72-73      1.3 PCR引物设计和线性打靶DNA的制备  73-74      1.4 DE205B电击感受态细胞的制备及电击转化  74      1.5 DE205B/pKD46电击感受态细胞的制备及电击转化  74      1.6 缺失株的筛选与鉴定  74-75      1.7 互补株的构建  75-76      1.8 生长曲线的测定  76-77      1.9 荧光定量PCR进行表达量分析  77-78      1.10 半数致死量(LD50)的测定  78-79      1.11 动物感染实验  79      1.12 细胞侵袭试验  79    2 结果  79-85      2.1 线性打靶DNA的制备  80      2.2 缺失株的PCR鉴定  80-81      2.3 补株的构建  81-82      2.4 Real-time PCR  82      2.5 半数致死量(LD50)的测定  82-83      2.6 动物感染试验  83-84      2.7 生长曲线的测定  84-85      2.8 细胞侵袭试验  85    3 讨论  85-87    参考文献  87-88    ABSTRACT  88-90全文总结  90-92致谢  92

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医基础科学 > 家畜微生物学(兽医病原微生物学) > 病原细菌
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