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Thermobifida Halotolerans YIM 90462~T木聚糖酶基因克隆表达以及酶学特性研究

作　者: 陈鸠鸠
导　师: 林连兵；李文均
学　校: 昆明理工大学
专　业: 微生物学
关键词: 木聚糖酶 克隆 表达 酶学性质
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本研究选取了目前关注较多的高温放线菌为研究材料。Thermobifida halotolerans YIM 90462T是云南大学省微生物研究所放线菌研究室2008年在云南省黑井盐矿分离并经多相分类研究确定的高温双歧菌属的一个新种。而高温双歧菌属一般都具有分泌木聚糖酶的能力,目前研究较透彻的是Thermobifida fuscaYX分泌的木聚糖酶,其中涉及到通过对其基因改造进而提高酶学活力方面的内容。2009年云南大学胡松楠曾通过蛋白酶的纯化工艺从T. halotolerans发酵液中分离到具有嗜高温,耐碱性等特殊的酶学性质的木聚糖酶Xyn I。本研究希望利用分子遗传学操作手段对其木聚糖酶基因进行克隆、表达并获取相关基因序列,同时研究其酶学性质,探讨其工业应用潜力。研究的实验结果如下：1.对高G+C含量T. halotolerans YIM 90462T木聚糖酶基因扩增的方法进行了探索研究,寻找最佳的实验方案。运用在线软件CODEHOP设计相应的简并引物扩增到了T. halotolerans YIM 90462T木聚糖酶基因的保守区域。先后用5种不同的PCR技术对已知保守区域的侧链基因序列扩增,并对其的实验原理、优点、缺陷进行了比较说明。以及为其它高G+C含量的放线菌功能基因的扩增提供一个可参考的实验方案的。2.扩增到了T. halotolerans YIM 90462T属于第11家族的木聚糖酶完整基因序列,命名为：Xyn11-1. Xyn11-1基因有1008个碱基对,编码335个氨基酸残基。理论分子量大约为35 kDa,理论等电点9.34。根据氨基酸序列的三级结构的同源模建,保守区分析,序列比对以及系统进化分析表明,Xynll-1是属于第11家族的嗜高温木聚糖酶。3.成功完成了原核表达载体(Xyn11-1-pET28a/BL21)的构建工作,以及酶的诱导表达及纯化。对重组Xyn11-1木聚糖酶的酶学特性研究表明,其最适反应温度为70℃,最适反应pH为9.0。部分金属离子对重组Xynl 1-1木聚糖酶酶活具有激活或抑制作用,且活性部位可能含有丝氨酸及二硫键。研究的亮点：1.获得了嗜热耐盐放线菌新菌种T. halotolerans一个第11家族的木聚糖酶基因；2.采用了基于染色体基因定位的染色体步行的PCR技术体系。

全文目录


摘要  4-6ABSTRACT  6-8目录  8-12插图和附表清单  12-14文献综述  14-26  1.1 木聚糖酶  14-15  1.2 木聚糖酶的作用机制  15-17    1.2.1 保持异头构型的两步置换反应  15-16    1.2.2 倒位异头构型的一步置换反应  16-17  1.3 产木聚糖酶的极端微生物  17  1.4 各种极端微生物木聚糖酶的研究概况  17-20    1.4.1 嗜热微生物的木聚糖酶  17-18    1.4.2 嗜冷微生物的木聚糖酶  18-19    1.4.3 嗜碱微生物的木聚糖酶  19    1.4.4 嗜酸微生物的木聚糖酶  19-20    1.4.5 嗜盐微生物的木聚糖酶  20  1.5 嗜极性微生物木聚糖酶的应用  20-23    1.5.1 木聚糖酶在造纸业中的应用  21    1.5.2 木聚糖酶在食品中的应用  21-22    1.5.3 木聚糖酶在饲料应用  22    1.5.4 木聚糖酶在能源转化方面的应用  22    1.5.5 在其它方面的应用  22-23  1.6 木聚糖酶基因克隆与表达的研究概况  23  1.7 木聚糖酶的研究方法及热点  23-24  1.8 高温木聚糖酶的研究意义  24-26前言  26-27第一部分 T.halotolerans木聚糖酶基因扩增方法的探索以及信息学分析  27-57  第一章 T.halotolerans YIM 90462~T木聚糖酶基因扩增方法的探索  28-48    1.1 实验材料  28      1.1.1 菌种和质粒  28      1.1.2 实验用培养基  28    1.2 T.halotolerans YIM 90462~T木聚糖酶基因扩增准备工作  28-29      1.2.1 T.halotolerans YIM 90462~T的培养  28-29      1.2.2 T.halotolerans YIM 90462~T基因组DNA的提取  29    1.3 木聚糖酶基因的扩增方法探索  29-46      1.3.1 保守序列扩增  29-35      1.3.2 设计木聚糖酶N-和C-端的简并引物  35-36      1.3.3 TaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kit  36-37      1.3.4 反向PCR技术  37-40      1.3.5 基于染色体基因定位的染色体步移的PCR技术  40-42      1.3.6 Site Finding-PCR方法  42-45      1.3.7 基因序列的拼接  45-46    1.4 总结与讨论  46-48  第二章 T.halotolerans YIM 90462~T木聚糖酶基因信息学分析  48-57    2.1 Xyn11-1木聚糖酶全基因序列分析  48-55      2.1.1 Xyn11-1木聚糖酶基因序列  48-49      2.1.2 Xyn11-1木聚糖酶基因保守区分析  49-50      2.1.3 Xyn11-1木聚糖酶的分子量和等电点预测  50      2.1.4 Xyn11-1木聚糖酶信号肽的预测  50-51      2.1.5 Xyn11-1木聚糖酶二级结构的分析  51-53      2.1.6 Xyn11-1木聚糖酶同源模建  53      2.1.7 序列比对和系统进化分析  53-55    2.2 实验结果与讨论  55-57第二部分 T.halotolerans Xyn11-1木聚糖酶基因克隆与表达  57-78  第三章 T.halotolerans YIM 90462~T Xyn11-1木聚糖酶原核表达体系的构建  58-64    3.1 材料  58      3.1.1 质粒和宿主  58    3.2 实验方法  58-62      3.2.1 引物设计与合成  58      3.2.2 T.halotolerans YIM 90462~T Xyn11-1基因的PCR扩增  58-60      3.2.3 原核表达体系(Xyn11-1-pET28a/BL21)的构建  60-62    3.3 实验结果与讨论  62-64  第四章 重组T.halotolerans YIM 90462~T Xyn11-1木聚糖酶的表达以纯化  64-68    4.1 刚果红初步检测  64-65    4.2 重组T.halotolerans YIM 90462~T Xyn11-1木聚糖酶诱导表达  65    4.3 重组T.halotolerans YIM 90462~T Xyn11-1木聚糖酶的纯化  65    4.4 SDS-PAGE检测  65-66    4.5 实验结果与讨论  66-68  第五章 重组T.halotolerans YIM 90462~T Xyn11-1木聚糖酶的酶学性质研究  68-78    5.1 木聚糖酶的测定方法  68-70      5.1.1 木聚糖酶活力的测定  68-69      5.1.2 蛋白质含量测定  69-70    5.2 木聚糖酶性质研究  70-74      5.2.1 最适温度测定  70-71      5.2.2 最适催化pH测定  71-72      5.2.3 金属离子的耐受性  72-73      5.2.4 抑制剂对酶活力的影响  73-74      5.2.5 相对分子质量的测定  74    5.3 实验结果与讨论  74-78总结  78-80展望  80-81致谢  81-82参考文献  82-88附录A 攻读硕士期间发表论文目录  88-89附录B 主要溶液的配制方法  89-91附录C 主要试剂、酶制剂和试剂盒  91-92附录D 主要仪器和设备  92

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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