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表达猪2型圆环病毒Cap蛋白重组沙门氏菌的构建及鉴定

作　者: 陈冬焕
导　师: 何启盖
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪2型圆环病毒 ORF2基因单克隆抗体猪霍乱沙门氏菌 C500株基因表达
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

猪2型圆环病毒(Porcine circovirus type 2,PCV2)是当前严重危害世界养猪业的重要病原之一。该病毒与猪的多种疾病综合征有关,特别是断奶仔猪多系统衰竭综合征,该病最早于1991年在加拿大西部发现,随后以极高的感染率迅速在全球蔓延流行,其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、苍白及黄疸等。PCV2在猪群中的感染率非常高,但多为隐性感染,该病主要侵害机体的免疫系统,导致免疫抑制,造成继发感染,给全球养猪业造成巨大的经济损失。对本病的预防除加强饲养管理、搞好环境卫生和减少应激外,最主要的途径就是依靠疫苗,因此,研制安全、高效、制备方便和廉价的新型基因工程疫苗成为越来越多研究者关注的焦点。本研究对PCV2新型疫苗进行了新的探索,构建了利用猪霍乱沙门氏菌载体系统表达Cap蛋白的重组菌,利用重组菌对小鼠进行了免疫学效力研究,主要研究内容如下:1.猪2型圆环病毒Cap蛋白单克隆抗体的制备利用本实验室构建的PCV2-ORF2重组菌经IPTG诱导表达,得到融合蛋白GST-Cap,采用谷胱甘肽琼脂糖凝胶对可溶性蛋白进行纯化,并作为免疫原采取常规皮下免疫与尾静脉冲击免疫结合的方式免疫BALB/c小鼠。取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选,采用有限稀释法进行克隆,经过3次克隆后获得了2株抗Cap蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为3E5和4H8。Western-blot和间接免疫荧光结果显示3E5和4H8株单克隆抗体能与Cap蛋白和PCV2发生特异性反应。其抗体亚类类型分别为IgG2a和IgG2b,轻链为κ型,细胞培养上清效价均为1:1024,小鼠腹水效价分别为1:409600和1:204800。这2株单抗的获得为进一步研究PCV2-ORF2基因的功能及建立准确快速诊断PCV2的方法提供了强有力的手段。2.表达猪2型圆环病毒Cap蛋白重组沙门氏菌的构建及鉴定根据GenBank中的已知序列设计2对引物,分别扩增PCV2-ORF2全基因和去核定位序列的ORF2基因,然后将两个片段分别亚克隆至含asd~+基因及β-lactamase信号序列的原核表达质粒pYA3493中,得到重组质粒pYA-ORF2和pYA-Δ41ORF2。将pYA-ORF2、pYA-Δ41ORF2和pYA3493分别电转化猪霍乱沙门氏菌C500的asd~-缺失株C501中,制备重组菌株C501(pYA-ORF2)、C501(pYA-Δ41ORF2)和空载体菌株C501(pYA3493)。SDS-PAGE鉴定表明,去核定位信号的ORF2基因可以表达,而含全基因序列的ORF2基因未表达。Western-blot结果表明:去核定位信号的ORF2基因表达的蛋白可以与抗PCV2-ORF2单克隆抗体发生特异性反应。研究结果表明,重组菌株C501(pYA-Δ41ORF2)不仅保留了亲本菌株C500的表型特征,且能稳定遗传并分泌表达外源蛋白。将5.9×10~9 CFU的重组菌C501(pYA-Δ41ORF2)分别以口服和肌肉注射途径免疫小鼠,结果显示两种免疫方法均可以诱导一定程度的ORF2特异的体液免疫反应,抗体从第1周开始略有上升,单剂量免疫组抗体从第4周开始下降,加强免疫后抗体上升。

表达猪2型圆环病毒Cap蛋白重组沙门氏菌的构建及鉴定

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