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猪瘟病毒和猪2型圆环病毒基因芯片检测技术研究
作 者: 张永涛
导 师: 李文刚
学 校: 河南农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 猪瘟病毒 猪2型圆环病毒 检测 基因芯片 应用
分类号: S858.28
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
本试验采用基因芯片技术、借助PCR和核酸标记技术,构建了猪瘟病毒和猪2型圆环病毒检测基因芯片。不仅为多种猪传染性疾病在同一张芯片上进行检测奠定基础,而且也为其他动物疫病应用基因芯片方法进行检测提供了理论依据。主要内容分为以下几个部分:1.CSFV-PCV2检测基因芯片目的基因的克隆及鉴定通过对CSFV和PCV2进行病原及分子生物学分析,参考GenBank和文献中报道的CSFV和PCV2基因序列,选择其保守序列并采用Primer Primier5.0软件设计引物。采用PCR或RT-PCR方法扩增目的基因,获得2个目的基因片段;用pMD18-T或pUCm-T克隆载体对目的基因进行克隆并对重组质粒进行PCR或酶切鉴定,然后进行测序。试验结果表明:目的基因被成功克隆。多重序列比对进一步表明:克隆鉴定的目的基因为病原体的高度保守基因,为CSFV-PCV2检测基因芯片的构建提供了确实可靠的材料。2.CSFV-PCV2检测基因芯片的构建通过对引物进行标记,使荧光素(Cy3)掺入到PCR产物中,通过对探针进行氨基修饰,使其更好的与经过醛基化的基片更好的结合,探针就能够更好的固定在基片上;通过对重组质粒PCR扩增产物与相应探针杂交温度和杂交时间的优化,筛选出了杂交特异性好的目的基因并确定了适宜的杂交温度和杂交时间,最后通过扫描仪对杂交结果进行扫描获取杂交图像并用计算机软件对杂交结果进行分析,完成CSFV-PCV2检测基因芯片的构建,结果如下:1)目的基因的制备:以目的基因重组质粒DNA为模板,采用PCR扩增、异丙醇沉淀法纯化目的基因,其浓度和纯度均符合芯片制作要求。2)确定了探针最适点样浓度为100ng/μL,筛选出了杂交信号强、杂交特异性好的目的基因,确定了CSFV-PCV2检测基因芯片的杂交温度为48℃,杂交时间为5h。3)确立了点样环境参数:相对湿度55-65%,温度15-30℃。各探针点间距为1.5mm。3.CSFV-PCV2检测基因芯片检测技术研究试验采用以PRV为阴性对照株,对构建的CSFV-PCV2检测基因芯片特异性进行了评价,结果表明:PRV阴性对照和空白对照均没有杂交信号,而CSFV和PCV2杂交信号明显且肉眼可见,基因芯片特异性好;将所提取的重组质粒按10倍梯度稀释至10-8,运用PCR方法和芯片方法分别对不同梯度的重组质粒进行检测并进行对比,以评价芯片检测方法的敏感性,结果表明:芯片检测方法的敏感性均好于PCR方法;通过对现地疑似样品进行检测,以评价基因芯片的应用效果,结果表明:基因芯片应用效果较好,能进一步进行试验研究。
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全文目录
致谢 4-9摘要 9-10第一章 文献综述 10-30 1 基因芯片技术及其在病原微生物研究中的应用 10-16 1.1 基因芯片的概念 10 1.2 基因芯片的分类 10 1.3 基因芯片的技术流程 10-12 1.3.1 基因芯片载体的选择 11 1.3.2 基因芯片的制备方法 11 1.3.3 基因芯片待检样品的制备方法及标记 11-12 1.3.4 基因芯片的杂交 12 1.3.5 基因芯片杂交信号的检测和分析 12 1.4 基因芯片技术在病原微生物研究中的应用 12-15 1.5 存在的问题与发展前景 15-16 2 猪瘟病毒分子生物学及诊断方法研究进展 16-23 2.1 猪瘟病毒分子生物学研究进展 16-19 2.1.1 猪瘟病毒的病原特性 16-17 2.1.2 猪瘟病毒基因组结构与功能 17-19 2.2 猪瘟病毒诊断方法研究进展 19-23 2.2.1 实验室诊断 19-23 3 猪圆环病毒分子生物学及诊断方法研究进展 23-30 3.1 猪圆环病毒分子生物学研究进展 23-25 3.1.1 病毒的基因组特征 23-24 3.1.2 病毒的结构蛋白特征 24-25 3.2 猪圆环病毒诊断方法研究进展 25-30 3.2.1 病毒分离 25-26 3.2.2 免疫学诊断方法 26-27 3.2.3 分子生物学诊断方法 27-29 3.2.4 核酸杂交(ISH) 29 3.2.5 DNA 芯片 29-30第二章 试验研究 30-61 试验一 CSFV-PCV2 检测基因芯片目的基因的克隆与鉴定 30-48 引言 30-31 1 材料与方法 31-39 1.1 材料 31-32 1.1.1 病毒 31 1.1.2 细胞和载体 31 1.1.3 主要试剂 31-32 1.1.4 试验仪器 32 1.2 方法 32-39 1.2.1 病毒核酸的提取 32-34 1.2.2 病毒核酸浓度的测定 34 1.2.3 引物的设计和标记 34 1.2.4 目的基因的 RT-PCR 及 PCR 扩增 34-35 1.2.5 目的基因的凝胶回收 35-36 1.2.6 目的基因的连接重组 36-37 1.2.7 目的基因的转化 37 1.2.8 目的基因重组质粒的鉴定 37-39 1.2.9 目的基因的序列测定 39 2 结果与分析 39-45 2.1 病毒核酸的提取及浓度的测定 39 2.2 目的基因引物设计结果 39 2.3 目的基因 PCR 扩增结果 39-40 2.4 目的基因的凝胶回收 40-41 2.5 目的基因克隆结果 41 2.6 目的基因重组质粒 PCR 鉴定 41 2.7 目的基因序列测定结果 41-45 2.7.1 CSFV 核苷酸序列比较结果 41-43 2.7.2 PCV2 核苷酸序列比较结果 43-45 3 结论与讨论 45-48 3.1 结论 45-46 3.2 讨论 46-48 3.2.1 目的基因的选择 46 3.2.2 目的基因引物设计 46 3.2.3 目的基因的 PCR 扩增、克隆和鉴定 46 3.2.4 目的基因的多重序列对位排列分析和 BLASTN 分析 46-48 试验二 CSFV-PCV2 检测基因芯片的构建 48-55 引言 48 1 材料与方法 48-52 1.1 材料 48-49 1.1.1 目的基因重组质粒 48 1.1.2 主要的试剂和材料 48-49 1.1.3 试验仪器 49 1.2 方法 49-52 1.2.1 PCR 引物的标记和探针的合成及修饰 49-50 1.2.2 基因芯片目的基因的制备及纯化 50 1.2.3 探针的稀释、固定与基因芯片的制备 50-51 1.2.4 基因芯片的杂交检测步骤 51-52 2 结果与分析 52-53 2.1 目的基因的制备及纯化 52 2.2 基因芯片杂交结果的分析 52-53 3 结论与讨论 53-55 3.1 结论 53 3.2 讨论 53-55 3.2.1 基因芯片的制作 53-54 3.2.2 目的基因的标记和探针的修饰 54 3.2.3 基因芯片杂交结果判定 54-55 试验三 CSFV-PCV2 检测基因芯片的检测技术研究 55-61 引言 55 1 材料与方法 55-57 1.1 材料 55 1.2 方法 55-57 1.2.1 CSFV-PCV2 检测基因芯片 55 1.2.2 CSFV-PCV2 检测基因芯片的特异性试验 55-56 1.2.3 CSFV-PCV2 检测基因芯片的敏感性试验 56 1.2.4 应用基因芯片对采集的临床样品进行检测 56-57 2 结果与分析 57-59 2.1 CSFV-PCV2 检测基因芯片的特异性试验结果 57 2.2 CSFV-PCV2 检测基因芯片的敏感性试验结果 57-58 2.3 CSFV-PCV2 检测基因芯片对临床样品的检测结果 58-59 3 结论与讨论 59-61 3.1 结论 59 3.2 讨论 59-61 3.2.1 基因芯片检测技术特点 59-60 3.2.2 CSFV-PCV2 检测基因芯片检测技术的敏感性、特异性研究 60-61参考文献 61-71英文摘要 71-73附录 73-77 附录一:主要培养基和溶液的配制 73-75 附录二:彩图 75-76 附录三:测序图 76-77
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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