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猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其初步应用

作　者: 朱蓓蓓
导　师: 钱平
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪瘟病毒单克隆抗体双抗体夹心ELISA 抗原检测
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 238次
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内容摘要

猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的猪的一种高度接触性、急性传染病,以发热和出血为主要特征。本病具有极强的传染性,可形成大范围流行,造成巨大的经济损失。预防和控制该病的关键措施是高效疫苗和准确的诊断方法。目前用于猪瘟的诊断技术种类很多,传统的ELISA多用于抗体的检测,一般用全病毒作为其包被抗原,存在散毒的危险。猪瘟病原检测是猪瘟病毒感染确诊的金标准,单抗具有特异性高的特点,因此基于单抗而建立的猪瘟病原诊断方法具有重要的应用前景。本研究开展了猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其应用的初步研究。本研究以纯化的CSFV为免疫原,免疫BALB/C小鼠,将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,用ELISA法筛选获得1株分泌抗CSFV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞,命名为2D1,其细胞上清和腹水的效价分别2~4和100×2~8,腹水纯化后浓度为2 mg/ml。免疫荧光试验表明该单抗能与猪瘟抗原特异性结合。在此基础上,结合抗CSFV单克隆抗体389建立了双抗体夹心ELISA方法检测猪瘟抗原。该方法特异性强,仅与猪瘟抗原反应,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪呼吸与繁殖障碍综合征症病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和乙脑病毒(JEV)均不起反应。本研究为进行研制检测猪瘟抗原的诊断方法奠定了基础。

全文目录

摘要  8-9
ABSTRACT  9-10
缩略词表(ABBREVIATION)  10-11
1 文献综述  11-21
  1.1 猪瘟及其危害  11-12
  1.2 猪瘟的分布与流行  12
  1.3 猪瘟病毒  12-17
    1.3.1 猪瘟病毒的形态特征  12-13
    1.3.2 猪瘟病毒的抗原性与变异性  13-14
    1.3.3 猪瘟病毒分子生物学研究进展  14-17
      1.3.3.1 猪瘟基因组的基本结构  14
      1.3.3.2 5'和3'-NTR的结构和功能  14-15
      1.3.3.3 开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)  15
      1.3.3.4 结构蛋白基因  15-16
      1.3.3.5 非结构蛋白基因  16-17
  1.4 猪瘟发病机理  17
  1.5 猪瘟的实验室诊断方法  17-19
    1.5.1 病毒的培养  17
    1.5.2 血清学诊断研究进展  17-18
    1.5.3 分子生物学诊断方法  18-19
  1.6 单克隆抗体在猪瘟病毒研究中的应用  19-21
    1.6.1 单克隆抗体的研究进展  19
    1.6.2 单克隆抗体在CSFV诊断及分子生物学研究中的应用  19-21
2 材料与方法  21-33
  2.1 材料与方法  21-33
    2.1.1 材料  21-24
      2.1.1.1 细胞、病毒与动物  21
      2.1.1.2 培养基及主要试剂  21
      2.1.1.3 培养基及主要试剂的配制  21-22
      2.1.1.4 ELISA相关溶液的配制  22
      2.1.1.5 染色体计数相关试剂的配制  22-23
      2.1.1.6 腹水纯化用试剂  23
      2.1.1.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)相关溶液  23-24
      2.1.1.8 其他试剂的配制  24
      2.1.1.9 抗体提供  24
    2.1.2 方法  24-26
      2.1.2.1 病毒粒子的大量制备与纯化  24-25
      2.1.2.2 引物设计  25
      2.1.2.3 总RNA的制备  25
      2.1.2.4 RT-PCR检测  25
      2.1.2.5 动物免疫  25-26
    2.1.3 间接ELISA检测方法的建立  26
      2.1.3.1 阴性血清与阳性血清的制备  26
      2.1.3.2 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定  26
    2.1.4 细胞融合  26-29
      2.1.4.1 SP2/0骨髓瘤细胞的制备  26-27
      2.1.4.2 免疫脾细胞的制备  27
      2.1.4.3 饲养细胞的制备  27
      2.1.4.4 细胞融合  27-28
      2.1.4.5 杂交瘤细胞上清检测  28
      2.1.4.6 杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)  28-29
      2.1.4.7 杂交瘤细胞的冻存和复苏  29
    2.1.5 单克隆抗体的鉴定  29-31
      2.1.5.1 杂交瘤细胞染色体数的检测  29-30
      2.1.5.2 单克隆抗体的生产、纯化和效价测定  30
      2.1.5.3 单克隆抗体亚类鉴定  30
      2.1.5.4 间接免疫荧光法检测单克隆抗体  30-31
      2.1.5.5 单抗特异性鉴定  31
    2.1.6 酶标单克隆抗体的制备  31
    2.1.7 双抗体夹心ELISA方法的建立  31-33
      2.1.7.1 双抗体夹心ELISA的步骤  31-32
      2.1.7.2 单抗包被浓度的确定  32
      2.1.7.3 标记二抗浓度的确定  32
      2.1.7.4 特异性实验  32
      2.1.7.5 敏感性实验  32-33
3 结果与分析  33-42
  3.1 病毒的纯化  33-34
    3.1.1 病毒蛋白含量的测量  33
    3.1.2 纯化的病毒的检测  33-34
  3.2 细胞融合  34-35
    3.2.1 八次融合后结果分析  34
    3.2.2 细胞融合后结果观察  34-35
  3.3 杂交瘤细胞的筛选  35-37
    3.3.1 间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞  35-36
      3.3.1.1 抗原最佳包被浓度的确定  35-36
      3.3.1.2 单抗效价的检测  36
    3.3.2 单抗的特异性测定结果  36-37
  3.4 单克隆抗体的亚类鉴定  37
  3.5 间接免疫荧光结果  37-38
  3.6 腹水纯化结果  38
  3.7 单克隆抗体的稳定性分析  38-39
  3.8 杂交瘤细胞染色体数的检测  39
  3.9 双抗体夹心ELISA方法的建立  39-42
    3.9.1 2D1单抗最佳包被浓度的确定  39-40
    3.9.2 3B9单克隆抗体最佳工作浓度的确定  40
    3.9.3 敏感性测定结果  40
    3.9.4 特异性检测的结果  40-42
4 讨论  42-45
  4.1 抗原的制备  42
  4.2 小鼠的免疫  42
  4.3 细胞融合  42-43
  4.4 单抗的筛选  43
  4.5 克隆  43-44
  4.6 失败原因和影响因素  44
  4.7 双抗体夹心ELISA方法的建立  44-45
5 小结  45-46
参考文献  46-54
致谢  54

猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其初步应用

内容摘要

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