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甲型H1N1流感病毒(2009)HA蛋白的原核表达及酶免检测研究

作 者: 郭文丽
导 师: 王云龙
学 校: 河南师范大学
专 业: 细胞生物学
关键词: 甲型H1N1流感病毒(2009) 血凝素 原核表达 双抗体夹心ELISA
分类号: R392.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 26次
引 用: 1次
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内容摘要


2009年春季,一种新型甲型H1N1流感病毒,在短时间内迅速蔓延至全球,给人类的生命健康造成了极大的威胁,给各国带来了巨大的经济损失。本研究立项之初,国内外暂无针对此次甲型H1N1流感(2009)的商品化试剂盒,人群对此新型流感病毒普遍易感。因此,建立一种方便、快捷、灵敏的检测方法对于尽早地作出诊断和治疗、防止疫情的大流行具有重大意义。根据病毒核蛋白和基质蛋白抗原性的不同,流感病毒可以分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒根据其表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶的不同,又可以分为各种亚型。甲型流感病毒的8个基因节段共编码11种蛋白,其中第4节段RNA编码的HA蛋白是病毒表面最主要的糖蛋白,具有较强的免疫原性,可以激发体液免疫和细胞免疫,诱导机体产生针对流感病毒的中和抗体,是决定病毒毒力的主要因素。为了给甲型H1N1流感(2009)的及早诊断和防治提供依据,本论文选择HA蛋白作为研究对象,采用原核表达系统表达目的蛋白,将由其免疫获得的单抗用于甲型H1N1流感病毒(2009)酶免检测方法的探索。主要的研究内容由两部分组成:1. HA抗原的表达:根据GenBank公布的甲型H1N1流感病毒(2009)血凝素基因序列,人工合成HA基因,构建原核表达载体pET-30 Xa/LIC-HA。阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃,0.1mM IPTG条件下诱导表达。重组蛋白采用镍离子亲和层析法进行纯化。对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western blot检测。结果表明,HA基因获得表达,产物以包涵体形式存在,相对分子量约62kD,具有较好的免疫反应性。2.甲型H1N1流感(2009)双抗体夹心检测方法的初步建立:以基因工程表达的HA重组蛋白作免疫原制备单抗,选择其中的两株配对单抗建立甲型H1N1流感病毒(2009)HA抗原双抗体夹心ELISA法,并对该方法的特异性、灵敏度、精密性和稳定性进行评估。结果表明,该方法能特异性地检出甲型H1N1流感病毒(2009),而与H1N2、H3N2、H5N1和乙型流感病毒无交叉反应;对HA抗原的最低检出限达到1ng/mL,且具有较好的精密性和稳定性。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
缩略语  10-11
第一章 引言  11-22
  1.1 流感病毒概述  11-13
    1.1.1 病原学  11-12
    1.1.2 主要的免疫原性蛋白  12-13
    1.1.3 流感病毒的抗原变异  13
  1.2 甲型H1N1 流感病毒(2009)概述  13-16
    1.2.1 流行病学  14-15
    1.2.2 病原学  15
    1.2.3 抗原特征  15-16
  1.3 流感病毒血凝素蛋白的研究进展  16-17
  1.4 流感检测方法研究进展  17-20
    1.4.1 传统的检测方法  17-19
    1.4.2 分子生物学诊断技术  19-20
  1.5 甲型H1N1 流感病毒(2009)的检测  20-21
  1.6 本研究的目的和意义  21-22
第二章 材料与方法  22-40
  2.1 材料  22-28
    2.1.1 菌株  22
    2.1.2 载体  22-23
    2.1.3 主要仪器与设备  23-24
    2.1.4 主要试剂  24-25
    2.1.5 主要溶液的配制  25-28
  2.2 方法  28-40
    2.2.1 构建甲型H1N1 流感病毒(2009)HA 重组质粒  28-32
    2.2.2 HA 蛋白的原核表达、纯化及鉴定  32-34
    2.2.3 甲型H1N1 流感病毒(2009)双抗体夹心检测方法的初步建立  34-40
第三章 结果  40-50
  3.1 构建甲型H1N1 流感病毒(2009)HA 重组质粒  40-42
    3.1.1 甲型H1N1 流感病毒(2009)HA 全长基因的设计、合成  40-41
    3.1.2 重组质粒的双酶切鉴定  41-42
    3.1.3 测序  42
  3.2 HA 蛋白的原核表达、纯化及鉴定  42-43
    3.2.1 原核表达产物的电泳结果  42
    3.2.2 重组蛋白的Western Blot 鉴定  42-43
    3.2.3 重组蛋白的纯化  43
  3.3 甲型H1N1 流感病毒(2009)双抗体夹心检测方法的初步建立  43-50
    3.3.1 质控品的建立  43-44
    3.3.2 包被抗体与酶标抗体最佳工作浓度的确定  44
    3.3.3 包被条件的优化  44-46
    3.3.4 酶标稀释液的配制  46-47
    3.3.5 显色反应系统的研究  47
    3.3.6 试剂反应时间的优化  47-48
    3.3.7 特异性  48
    3.3.8 灵敏度  48
    3.3.9 精密性  48-49
    3.3.10 对临床标本的检测及考核  49
    3.3.11 稳定性  49-50
第四章 讨论  50-53
  4.1 目的基因的选择  50
  4.2 载体的选择和纯化条件的摸索  50-51
  4.3 甲型H1N1 流感病毒(2009)双抗体夹心ELISA 法的建立  51
  4.4 展望  51-53
第五章 结论  53-54
参考文献  54-58
附录  58-60
致谢  60-61
攻读学位期间发表的学术论文目录  61-62

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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