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人类APPL2蛋白PTB结构域的表达纯化及其功能的研究

作　者: 梁宁
导　师: 吴东海
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 细胞生物学
关键词: APPL2 PTB 表达纯化噬菌体展示
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

APPL蛋白,包括APPL1和APPL2,是细胞膜与细胞核之间重要的信息传递者,同时也为细胞增殖所必需。APPL蛋白包括BAR结构域(bin-amphysin-rvs),PH结构域(pleckstrin homology)和PTB结构域(phosphotyrosine binding),且均可与一系列不同的信号分子相互作用,从而发挥传递信号的作用。APPL蛋白仅存在于真核生物中,至今已发现APPL1和APPL2两种亚型,两者在一级序列上有54%的同源性。APPL1最早是通过酵母双杂交筛选,发现可以与丝氨酸/苏氨酸激酶AKT2相互作用。随着对APPL蛋白研究的发展,不断有新的理论和发现被报道出来。比如,APPL1被发现可以与多功能抗凋亡激酶AKT2的非活性形式相互作用。然后后来发现非活性形式AKT主要存在于胞质溶胶中,因此AKT2似乎不大可能与APPL蛋白共定位于内涵体。另外,肿瘤抑制蛋白(deleted in colorectal carcinoma, DCC)也是APPL1另一个相互作用因子。在配体不存在的情况下,DCC通过对半胱天冬酶-3 (caspase-3)和半胱天冬酶9 (caspase-9)的激活介导了细胞凋亡,而这一过程正是需要APPL1的参与。DCC通过APPL1的作用,可以激活p53,这是NuRD/MeCP1复合体的组成部分。p53的激活会导致细胞生长的停止或者凋亡,虽然这也依赖于不同条件对下游转录信号的刺激。另外,DCC还可以通过介导在神经细胞内的信号通路。另外,APPL1和APPL2被证明都可以通过PTB结构域与胞吞作用调节因子Rab5相互作用。最近,Nechamen等人报道APPL2不但可与FSHR相互作用,而且可以与APPL1通过BAR结构域在N端形成二聚体。PTB结构域通过与磷酸化酪氨酸的结合,在多个信号通路上发挥关键作用。然而,这种结合也可以不依赖于磷酸化酪氨酸。APPL蛋白的PTB结构域包括两个反向平行β折叠片和三个α螺旋,这与葡萄糖转运因子GLUT2和促进凋亡细胞吞食的蛋白因子CED-6有相似性。尽管APPL1和APPL2在PTB结构域上显示了较高的序列同源性,但有些蛋白已经被证实只与APPL1结合,这表明两者可能以不同,甚至拮抗的方式发挥作用。因此,确定APPL2的相互作用分子有相当的重要性。本研究在大肠杆菌表达体系中,表达并纯化了人类APPL2 (human APPL2, hAPPL2)蛋白PTB结构域,然后以此为靶标,利用噬菌体展示技术筛选相互作用肽段。经过三轮筛选,随机挑取48个噬菌体单克隆,进行ELISA分析。7肽序列ERLPFFY和YLTSPKH被证明能与PTB结构域特异地结合。对P3-GST的野生型和将每个氨基酸突变为丙氨酸的突变型的ELISA检测,显示每个氨基酸均是结合所必需的。本研究对关于hAPPL2的PTB结构域功能的进一步研究有参考意义。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第1章绪论  11-23
  1.1 引言  11-12
  1.2 APPL 蛋白概述  12-15
  1.3 BAR 和PH 结构域概述  15-16
  1.4 PTB 结构域概述  16-19
  1.5 噬菌体展示技术概述  19-23
第2章实验材料  23-28
  2.1 载体和菌株  23
  2.2 噬菌体展示环7 肽库  23
  2.3 试剂与材料  23-24
  2.4 主要仪器  24-25
  2.5 试剂配制  25-28
第3章实验材料与方法  28-46
  3.1 pET28a(+)-PTB 质粒载体的构建  28-31
  3.2 重组PTB 结构域的表达与纯化  31-35
    3.2.1 重组PTB 结构域的表达  32-33
    3.2.2 重组PTB 结构域的镍亲和层析柱纯化  33-35
    3.2.3 重组PTB 结构域的Superdex 75 10/300 GL 分子筛检测  35
  3.3 噬菌体展示环7 肽库的亲和筛选  35-38
  3.4 噬菌体ELISA  38
  3.5 DNA 测序及PCR 分析  38-40
  3.6 GST 融合蛋白表达载体的构建  40-41
  3.7 GST 融合蛋白的表达，纯化  41-43
  3.8 GST 融合蛋白ELISA  43
  3.9 GST-P3 突变体表达载体的构建  43-45
  3.10 GST-P3 突变体的表达，纯化和ELISA  45-46
第4章实验结果  46-55
  4.1 pET28a(+)-PTB 表达载体的构建  46
  4.2 PTB 重组蛋白的表达与纯化  46-48
  4.3 噬菌体展示环7 肽库的亲和筛选  48-55
第5章讨论  55-58
参考文献  58-69
致谢  69-70
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果  70

人类APPL2蛋白PTB结构域的表达纯化及其功能的研究

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