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人血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因-Mip3β双表达质粒的构建及鉴定

作　者: 邹建军
导　师: 张积仁
学　校: 南方医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: Mip3β 模拟多肽 FAS 血型抗原噬菌体展示技术
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景据世界卫生组织最新资料,全世界大约有癌症病人1400万,每年约有200万新发癌症患者,死亡500万,每死亡10个人中就有一个死于癌症。恶性肿瘤是人类三大死因之一,仅次于心脑血管病和意外事故。在发达国家中占各类死亡原因的第1或第2位。而肿瘤的发病一直呈上升趋势,美国NCI权威机构公布,美国近20年间癌症的死亡率从16%增长到23%。专家预测,由于人口老龄化、吸烟、生活方式城市化及工业化进程等多种原因,在今后的二三十年内肿瘤的发病及死亡率仍将继续呈上升趋势。当然,肿瘤发生是一个极其复杂的过程。以往的肿瘤研究往往着重于肿瘤细胞自身,试图从癌细胞本身基因与表型改变来解释肿瘤的发生及进展。随着基因、分子生物学技术的进展,人们发现,肿瘤的形成和进展不单只与肿瘤细胞本身有关,也与肿瘤微环境有关。肿瘤微环境是肿瘤细胞在其发生发展过程中所处的内环境,由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞,如树突状细胞、巨噬细胞等共同组成。微环境与肿瘤细胞之间关系复杂,它们相互作用,并反映、改变甚至逆转了肿瘤生物学特性,对肿瘤表观遗传学、干细胞、免疫逃逸、转移潜能等产生重要的影响。浸润在肿瘤微环境中的免疫细胞,其抗肿瘤效应的下降有利于恶性肿瘤的进展、新生血管的形成及向远处的转移。如何打破肿瘤微环境的抑制状况,是肿瘤治疗一重要途径。长期以来,肿瘤的治疗多采用手术,放疗和化疗三大常规方法。在一百多年前,Caley用细菌疫苗免疫机体时,就观察到肿瘤会缩小。随后人们逐渐认识到肿瘤细胞可以激发机体产生免疫反应,而免疫系统本身对肿瘤也具有监视作用。机体抗肿瘤免疫由先天性免疫(非肿瘤特异性免疫)和获得性免疫(肿瘤特异性免疫)组成,二者共同参与机体免疫监视和抗肿瘤效应。随着人们对基础免疫研究的深入,对免疫系统针对肿瘤的识别和肿瘤逃避免疫监视等的机制有了更深的理解。肿瘤细胞作为抗原引起机体免疫反应通常需要两个步骤,第一步是抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APCs)摄取并加工肿瘤抗原以MHC-Ⅰ肽或MHC-Ⅱ肽提呈给CD8或CIM T淋巴细胞。第二步是APCs表达高水平的共刺激分子(B7-、ICAM-1、LFA-1等)与抗原特异性T淋巴细胞表面的受体(CD28、TJFA-1、CD2等)结合,进而诱发机体的抗肿瘤细胞免疫应答。根据机体免疫监控和肿瘤抗原的表达原理,肿瘤在恶变和转移过程中理论上应引起免疫反应,抑制肿瘤的生长。也正是根据免疫系统对肿瘤有抑制作用,肿瘤的免疫治疗越来越受到重视。细胞过继免疫治疗曾被认为是最有前景的免疫治疗法,该方法是将患者的免疫细胞进行体外培养,加入肿瘤特异性抗原和细胞因子刺激,筛选出具有高度特异性肿瘤杀伤效应的免疫细胞并进行大量扩增,然后再回输到患者体内以杀灭肿瘤。由于此方法克服了人体内肿瘤免疫耐受中肿瘤抗原呈递效率低下和效应性淋巴细胞不足的两个关键问题,通过此方法,在体外研究中,得到了较好的肿瘤杀伤效应,但体内应用效果却远逊于体外,并不能得到显著的免疫杀伤效应。因为肿瘤细胞不仅被动的逃避免疫系统的攻击,同时也主动的抑制其生长环境中的免疫细胞的正常功能。最近研究表明,肿瘤微环境内的免疫耐正受是导致这种情况发生的最关键原因。肿瘤微环境内可以导致肿瘤局部免疫耐受发生的因素有多种,机制也不一样,大致有以下几种：局部效应细胞功能障碍、抑制性免疫调节细胞Treg、细胞因子的免疫负调节作用、抑制性配体受体反应以及肿瘤微环境中T细胞代谢活性的负调节等。由于肿瘤微环境处于免疫抑制状态,免疫系统不能有效呈递肿瘤抗原,因此针对肿瘤的特异性免疫过程无法启动,也就无法激活免疫效应细胞。正是因为这种情况,重建体内的免疫反应过程,促使特异性识别肿瘤细胞抗原的T细胞增殖与分化,是肿瘤免疫治疗的核心。在肿瘤的免疫治疗中,肿瘤疫苗的研究越来越多,其设计策略的思路是应用各种技术,增强免疫系统对肿瘤抗原的识别能力,改善免疫微环境,引发有力的特异性抗肿瘤细胞免疫,阻止肿瘤进展,最终消除肿瘤。目前人们尝试在基因水平上来进行抗肿瘤治疗,其方法主要是通过注射肿瘤基因疫苗,特别是用非病毒载体如质粒载体等来携带目的基因制作的疫苗,来观察其抗肿瘤免疫反应。基因疫苗(genetic vaccine)治疗肿瘤是利用基因工程技术将编码肿瘤特异性抗原的基因结合于表达载体上,再将疫苗直接注入机体,借助载体本身和机体内的基因表达系统表达出期望的抗原,从而诱导特异性的细胞免疫应答。其抗肿瘤免疫机制包括直接诱导特异抗肿瘤作用和间接增强机体免疫反应两方面。在肿瘤基因疫苗研究中,如何选择针对性强的肿瘤相关抗原编码基因,以及如何有效保证目的基因在体内充分表达,是该基因疫苗研制的关键。目前的各种肿瘤的治疗方法均不能很好地改善肿瘤微环境中免疫功能抑制状态,现在尚没有较好的方法打破肿瘤内环境对免疫细胞的抑制作用。针对这一问题,我们从临床器官移植后发生的超急性排斥反应得到启发,在受者体内预先存在有抗供者组织抗原的抗体,它们能与抗原相结合,并通过激活补体而迅速破坏靶细胞,或通过补体激活所产生的活性片段引起炎性反应,从而导致毛细血管和小血管内皮细胞损伤、纤维蛋白沉积和大量血小板聚集,并形成血栓,导致移植器官发生不可逆性坏死。血型抗原可以引起很强的抗血型免疫反应,能激发和增强机体的特异与非特异免疫功能。血型抗原是一类具有很强的免疫原性和抗原性的同种异型抗原,我们构想将抗血型免疫反应引入肿瘤局部,可能会增强机体的特异与非特异免疫功能,也试图改善肿瘤局部免疫抑制状态,促进DC呈递肿瘤抗原,激发CTL杀伤肿瘤细胞活性。本研究就是建立在这种设想上设计实验的。具体实验包括以下几方面：(1)人血型A抗原模拟多肽的获取；(2)人血型A抗原模拟多肽FAS融合基因、Mip3β-pIRES双表达重组质粒的构建及鉴定。第一部分人血型A抗原模拟多肽序列的获取目的：模拟人血型A抗原模拟多肽,获得阳性克隆。方法：使用随机12肽库筛选试剂盒,按照试剂盒说明书应用常规M13方法筛选人血型A抗原模拟多肽,并行ELISA检测,挑选阳性克隆。结果：筛选得到的人血型A抗原模拟多肽基因序列为CCTAACCACAGCCCTAAAAGCCTTAGAATCCACATA,其氨基酸序列为：YVD-SKA-FRA-VVR。结论：应用随机12肽文库成功获得了人血型A抗原模拟多肽。第二部分人血型A抗原模拟多肽/FAS融合基因、Mip3β-pIRES双表达重组质粒的构建及鉴定目的：人血型A抗原模拟多肽/FAS融合基因、Mip3β-pIRES双表达重组质粒的构建及鉴定。方法：扩增巨噬细胞炎症蛋白3β基因,经双酶切后克隆入质粒pIRES的多克隆位点B(MCS B),构建人血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因-Mip3β-pIRES表达质粒。PCR扩增血型A抗原模拟多肽和Fas基因的融合基因,酶切后连接克隆入真核表达质粒pIRES的多克隆位点A (MCS A)结果：成功地构建了人血型A抗原模拟多肽/FAS融合基因、Mip3β-pIRES双表达重组质粒。结论：构建了人血型A抗原模拟多肽/FAS融合基因、Mip3β-pIRES双表达重组质粒,并经初步鉴定,重组质粒构建成功。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-15
前言  15-19
第一部分人血型A抗原模拟多肽序列的获取  19-45
  1. 材料和方法  19-31
  2. 具体步骤  31-32
  3. 结果  32-41
  4. 讨论  41-45
第二部分人血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因-Mip3β双表达重组质粒的构建及鉴定  45-66
  1. 材料和方法  46-48
  2. 方法  48-59
  3. 结果  59-62
  4. 讨论  62-66
展望  66-68
全文总结  68-69
参考文献  69-73
英文缩写词表  73-75
攻读硕士期间参与发表的文章  75-76
致谢  76-78
统计学证明  78

人血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因-Mip3β双表达质粒的构建及鉴定

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