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Necl家族蛋白胞外区的表达纯化与胞内区相互作用蛋白的筛查

作　者: 李晨
导　师: 袁建刚；强伯勤；彭小忠
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Necl 蛋白表达昆虫表达系统酵母双杂交筛选
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

Nectin-like（Necl,也称为CADM或SynCAM）蛋白属于免疫球蛋白超家族,共有5个成员,Necl1、Necl2、Necl3、Necl4和Necl5。其结构相对保守,都含有由3个Ig-like结构域组成的胞外区、单次跨膜区和一个短的胞内区。Necl家族成员与Nectin家族成员,都是Ca²⁺非依赖性的细胞黏附分子,这些分子间存在着广泛的同源或异源的相互作用。Necl家族分子是神经系统特异表达或高表达的,通过同源或异源的相互作用在细胞粘附、突触形成、髓鞘发生等过程中起着重要的作用。已有研究表明,外周神经系统中Necl1与Necl4间的相互作用对于施旺细胞形成髓鞘十分重要。而Necl2是一个肿瘤抑制因子并且可以调节突触的形成。Necl家族分子间广泛的相互作用正是其功能所必需的,而这种作用是由胞外区介导的并与其糖基化形式相关。在本实验室的前期工作中,我们解析了Necl1胞外区第一个V domain的三级结构,发现Necl1胞外区第72位的苯丙氨酸对其形成二聚体很重要。另有实验室报道了Necl5的前两个结构域的晶体结构以及其与脊髓灰质炎病毒相互作用的位点。本论文主要研究Necl1、Necl2、Necl3和Necl4四种蛋白胞外区的表达。实验中选用了Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,这是一种通过位点特异的转座作用产生用于表达的重组杆状病毒的系统。从成年小鼠脑的cDNA中克隆出四种基因的编码区,并将其插入到经过改造的供体质粒pFastBac ^TMDual-Hemolin/Gp67-3C-His中。将构建好的供体质粒转化大肠杆菌DH10Bac^TM,在辅助质粒的帮助下,供体质粒与Bacmid发生同源重组,将外源基因片段插入到Bacmid中。重组的Bacmid转染Sf9细胞,获得用于表达的重组杆状病毒。我们用低MOI值的P1代重组杆状病毒感染Sf9细胞,扩增表达所需的病毒,并用实时定量PCR的方法测定病毒的滴度。为了确定表达目的蛋白的最适宜条件,我们进行了一系列的实验。首先,将带有不同信号肽以及野生型和糖基化位点突变型的Necl1的重组病毒感染昆虫细胞,检测不同的信号肽序列对外源蛋白的分泌量的影响,以及外源蛋白Necl1自身的糖基化位点对表达后修饰的影响。结果表明,实验中所选用的分别带两种信号肽的外源蛋白的分泌无明显差异,而Necl1蛋白不存在糖基化修饰。然后,比较了在相同感染条件下,Sf9和Sf21两种细胞株的外源蛋白表达量是否存在差异。第三,采用两种培养基及6种血清浓度进行外源蛋白的表达,优化培养条件。第四,分别用不同MOI值的病毒感染Sf21细胞,确定用于感染的MOI值。第五,每24小时收取一次培养基上清,检测外源蛋白分泌量与时间的关系。最终确定了外源蛋白的最适表达条件为Sf21细胞株、Grace′s insect medium培养基、2%胎牛血清、MOI为8的病毒量和3天的培养时间,并应用此条件成功表达了四种蛋白。之后,我们用Ni柱对少量表达的外源蛋白进行初步纯化,并用不同浓度的咪唑进行洗脱,最后选择50mmol/L的咪唑浓度作为洗脱条件,获得了较高纯度的Necl4蛋白胞外区产物。Necl家族蛋白通过胞内区与细胞内信号通路发生作用。为了进一步研究Necl1蛋白的作用机制,我们利用酵母双杂交系统筛选与Necl1胞内区相互作用的蛋白。构建含人Necl1蛋白胞内区氨基酸编码序列的诱饵质粒pGBKT7-NECL1C,对人胎脑cDNA文库进行酵母双杂交筛选。酵母双杂交阳性克隆经测序后显示共存在9段不同序列（存在重复克隆）。比对氨基酸序列得到5个可能的相互作用蛋白。并通过GSTpull down实验验证了其中两个蛋白与Necl1胞内区的相互作用。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
前言  8-11
材料和方法  11-30
实验结果  30-44
讨论  44-48
小结  48-49
不足与展望  49-50
参考文献  50-54
综述  54-60
  参考文献  58-60
附录  60-61
个人简历  61-62
致谢  62-63

Necl家族蛋白胞外区的表达纯化与胞内区相互作用蛋白的筛查

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