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Cry1Aa-CpTI融合蛋白的原核表达及其对斜纹夜蛾杀虫活性研究

作　者: 王胜
导　师: 张春发；邓柳红
学　校: 海南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: CrylAa-CpTI 重组融合蛋白表达斜纹夜蛾
分类号: S482.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

斜纹夜蛾是一种暴食性害虫,严重影响农林生产,用大量化学杀虫剂对其防治产生环境污染,严重危害人畜健康,并易使斜纹夜蛾产生抗药性；生物杀虫剂成本高,杀虫速度慢,稳定性差。研究一种杀虫速度较快,稳定性较好,成本较低的生物杀虫剂,采用先用生物杀虫剂防治,再用化学杀虫剂补防的创新防治策略,充分发挥生物杀虫剂和化学杀虫剂的各自优势,客观实际地减少化学杀虫剂的用量,可能是斜纹夜蛾等害虫综合防治的较好策略。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, BT)是目前应用最为广泛的微生物杀虫剂。BT编码杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)的基因称为cry基因,其中cry1Aa基因编码对鳞翅目昆虫有杀虫活性的蛋白Cry1Aa,但该蛋白在实际应用中仍存在稳定性差,杀虫速度慢且受施用环境影响大的问题。豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor,CpTI)来自豇豆的可食用部分,具有抗虫谱广且昆虫不易对其产生耐受性的特点,已被作为抗虫植物基因工程一个重要的候选基因,转到烟草、水稻、棉花和番茄等多种作物中。CpTI在分类上属于Bowmun-Birk家族,大量医学研究表明,该家族蛋白质对于对人畜不存在任何危害。基于crylAa和cpti基因的优点,将两个基因进行融合,采用体外重组DNA技术,在大肠杆菌中大量表达Cry1Aa-CpTI融合蛋白,研究其对斜纹夜蛾的杀虫活性。首先以本实室保存含cry1Aa-cpti基因的PBI121质粒DNA为模板,PCR扩增cry1Aa-cpti基因,将cry1Aa-cpti基因连入pMD18-TSimeple克隆载体,测序结果表明连入的基因片段序列正确。其次将pMD18T-cry1Aa-cpti,经Nde I和Sal I双酶切,所获得的cry1Aa-cpti基因片段与具有NdeⅠ/SalⅠ末端的pET-30a相连接,构建表达载体pET-30a-cry1Aa-cpti。测序正确后,将表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3),构建BL21(DE3)/pET-30a-cry1Aa-cpti工程菌。然后用IPTG诱导工程菌表达Cry1Aa-CpTI包涵体融合蛋白,经细胞超声波破碎、包涵体缓冲液洗涤获得纯化的融合蛋白。十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在大约80.73 kD处有表达产物特异条带。通过对诱导温度(27、29、31、32、35、37、39-C)、诱导时间(1、2、3、4、5、6h)和IPTG诱导浓度(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L)等诱导条件的优化,以确定最佳诱导表达条件为37℃下,1mmol/LIPTG诱导3h,此时表达外源蛋白量最高。Cry1Aa-CpTI融合蛋白稳定性分析表明,在37℃条件下,4天内未见降解现象,第5天开始降解。室内活性测定表明,Cry1Aa-CpTI融合蛋白对2龄斜纹夜蛾幼虫有拒食作用,1 mg/mLCry1Aa-CpTI融合蛋白,处理时间为24h,拒食率为83.8%；杀虫处理时间为48h,出现死虫现象,平均死亡率为20%；杀虫处理时间为72h,平均死亡率为70%。甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(甲维盐)和毒死蜱是斜纹夜蛾田间2种常用农药,用饲料混毒法分别测定甲维盐和毒死蜱对2龄斜纹夜蛾幼虫LC50：处理24h,甲维盐的LC50为4.1363μg/L,毒死蜱为273.4257μg/L；处理48h,甲维盐的LC50为3.2784μg/L,毒死蜱为130.4301μg/L；处理72h,甲维盐的LC50为0.7279μg/L,毒死蜱LC50为115.1665μg/L。使用Cry1Aa-CpTI融合蛋白处理2龄斜纹夜蛾幼虫24h后,再测甲维盐和毒死蜱的室内毒性。处理24h,甲维盐的LC50为0.8257μg/L,降低了80.01%,毒死蜱为88.3617gg/L,降低了67.68%；处理48h,甲维盐的LC50为0.4083μg/L,降低了87.55%,毒死蜱为45.0294μg/L,降低了65.48%；处理72h,甲维盐的LC50为0.2242gg/L,降低了69.20%,毒死蜱为31.6220gg/L,降低了72.54%。处理24h、48h和72h,甲维盐LC50比单独使用平均降低了78.92%,毒死蜱平均降低了68.57%。斜纹夜蛾室内毒性测定结果表明：Cry1Aa-CpTI融合蛋白对斜纹夜蛾有较强的拒食作用,如先用Cry1Aa-CpTI融合蛋白处理2龄斜纹夜蛾幼虫,甲维盐和毒死蜱杀虫剂的平均使用量分别降低了78.92%和68.57%也能达到单独使用时的效果。因此,本研究首次原核表达Cry1Aa-CpTI融合蛋白具有开发为防治斜纹夜蛾新型生物杀虫剂的基础,所开发的制剂可与化学杀虫剂协同使用,采用先施用生物杀虫剂,再施用化学杀虫剂补防斜纹夜蛾害虫的策略,可大幅度减少化学杀虫剂的使用量,同时降低其产生抗药性,达到环保和防治双重效果。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-13
1. 前言  13-28
  1.1 国内外化学杀虫剂类型  13-17
    1.1.1 化学杀虫剂在农业病虫害防治中的优点  14-15
    1.1.2 化学杀虫剂存在问题  15-17
  1.2 国内外生物杀虫剂发展现状  17-19
    1.2.1 生物杀虫剂在农业病虫害防治中的优点  17-18
    1.2.2 生物杀虫剂存在问题  18-19
  1.3 BT毒蛋白基因的研究进展  19-22
    1.3.1 BT毒蛋白基因分类  20
    1.3.2 杀虫机理  20-21
    1.3.3 遗传工程菌研究  21-22
  1.4 CpTI研究进展  22-23
    1.4.1 CpTI杀虫机制  22-23
    1.4.2 cpti在抗虫基因工程中的应用  23
  1.5 融合基因及融合蛋白在植物抗病虫害中的研究进展  23
  1.6 斜纹夜蛾生物学特性及防治研究  23-25
    1.6.1 斜纹夜蛾生物学特性  23-24
    1.6.2 斜纹夜蛾防治  24-25
  1.7 本研究的目的和意义  25-26
  1.8 具体研究内容及实验技术路线  26-28
    1.8.1 具体研究内容  26
    1.8.2 研究技术路线  26-28
2. 材料与方法  28-44
  2.1 试验材料  28-30
    2.1.1 菌株与质粒  28
    2.1.2 主要生化试剂  28
    2.1.3 供试农药  28-29
    2.1.4 供试虫源  29
    2.1.5 常用培养基、试剂、缓冲液配方  29-30
      2.1.5.1 常用培养基配方  29
      2.1.5.2 常用试剂配方  29-30
    2.1.6 主要实验仪器  30
  2.2 实验方法  30-44
    2.2.1 BT cry1Aa-cpti融合基因的克隆及其DNA序列鉴定  30-36
      2.2.1.1 BT cry1Aa-cpti融合基因的克隆引物设计  30-31
      2.2.1.2 BT cry1Aa-cpti基因模板的获得  31
      2.2.1.3 BT cry1Aa-cpti不含Nde Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点基因的克隆  31-32
      2.2.1.4 BT cry1Aa-cpti含NdeⅠ和Sal Ⅰ酶切位点基因的克隆  32-33
      2.2.1.5 PCR产物的回收  33
      2.2.1.6 BT cry1Aa-cpti PCR product与克隆载体pMD18-T的连接  33-34
      2.2.1.7 E.coli DH5a感受态细胞的制备  34
      2.2.1.8 连接产物转化感受态细胞  34
      2.2.1.9 重组质粒DNA的初步筛选  34-35
      2.2.1.10 重组质粒DNA的小量制备  35-36
      2.2.1.11 BT cry1Aa-cpti基因克隆载体的鉴定  36
    2.2.2 Cry1Aa-CpTI融合蛋白原核表达载体的构建  36-39
      2.2.2.1 pET-30a-cry1Aa-cpti融合蛋白表达载体的构建  36-39
      2.2.2.2 pET-30a-cry1Aa-cpti融合蛋白表达载体鉴定  39
    2.2.3 融合蛋白在大肠杆菌中的表达及高效表达条件的建立  39-42
      2.2.3.1 工程菌株BL21(DE3)/pET-30a-cry1Aa-cpti的构建  39-40
      2.2.3.2 Cry1Aa-CpTI融合蛋白在大肠杆菌中的表达及高效表达条件的建立  40-42
    2.2.4 Cry1Aa-CpTI融合蛋白包涵体的纯化  42
    2.2.5 Cry1Aa-CpTI融合蛋白稳定性分析  42
    2.2.6 Cry1 Aa-CpTI融合蛋白杀虫活性的初试方法  42-43
    2.2.7 Cry1Aa-CpTI融合蛋白对斜纹夜蛾拒食作用实验  43
    2.2.8 甲维盐和毒死蜱2种农药对斜纹夜蛾幼虫的室内毒力测定  43-44
    2.2.9 Cry1Aa-CpTI融合蛋白饲喂24h后,2种农药对斜纹夜蛾幼虫的室内毒力  44
3. 结果与分析  44-60
  3.1 BT cry1Aa-cpti融合基因的获得与鉴定  44-47
    3.1.1 BT cry1Aa-cpti融合基因的获得  44-45
    3.1.2 引入Nde Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点的BT cry1Aa-cpti融合基因的获得  45
    3.1.3 克隆载体pMD18T-cry1Aa-cpti构建  45-46
    3.1.4 BT cry1Aa-cpti融合基因酶切鉴定  46-47
  3.2 表达载体pET-30a-cry1Aa-cpti的构建  47-50
    3.2.1 pET-30a双酶切  47-48
    3.2.2 表达载体pET-30a-cry1Aa-cpti的构建  48-49
    3.2.3 表达载体pET-30a-cry1Aa-cpti鉴定  49-50
      3.2.3.1 表达载体pET-30a-cry1Aa-cpti双酶切鉴定  49-50
      3.2.3.2 表达载体pET-30a-cry1Aa-cpti测序  50
  3.3 工程菌株BL21(DE3)/pET-30a-cry1Aa-cpti的构建  50
  3.4 Cry1Aa-CpTI融合蛋白的诱导表达及表达条件的优化  50-53
    3.4.1 Cry1Aa-CpTI融合蛋白的诱导表达  50-51
    3.4.2 Cry1Aa-CpTI融合蛋白的诱导表达条件的优化  51-53
  3.5 重组蛋白表达方式分析及包涵体的纯化  53-54
  3.6 Cry1Aa-CpTI融合蛋白稳定性分析结果  54-55
  3.7 Cry1Aa-CpTI融合蛋白杀虫活性的初试结果  55-56
  3.8 Cry1Aa-CpTI融合蛋白对斜纹夜蛾的拒食作用测定  56-57
  3.9 甲维盐和毒死蜱农药饲料混毒法毒力测定结果  57-58
  3.10 使用Cry1Aa-CpTI蛋白24h后,甲维盐和毒死蜱饲料混毒法毒力测定结果  58-60
4. 讨论  60-63
  4.1 Cry1Aa-CpTI融合蛋白载体构建  60
  4.2 关于融合蛋白诱导条件的优化  60-61
  4.3 关于Cry1Aa-CpTI纯化及稳定性  61
  4.4 关于Cry1Aa-CpTI融合蛋白能降低有毒农药的使用量的问题  61-63
5. 结论  63-64
6. 参考文献  64-68
附录1:cry1Aa-cpti融合基因DNA序列  68-69
附录2:Cry1Aa-CpTI融合蛋白AA序列  69
附录3:Cry1Aa-CpTI融合蛋白AA统计  69
附录4:pMD18-T Simple克隆载体图谱  69-70
附录5:pET-30a表达载体图谱  70-72
致谢  72

Cry1Aa-CpTI融合蛋白的原核表达及其对斜纹夜蛾杀虫活性研究

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