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紫红笛鲷组织蛋白酶S的鉴定与其在抗原呈递中的功能

作　者: 李磊
导　师: 蔡中华
学　校: 清华大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 组织蛋白酶S 蛋白表达抗原呈递 MHC恒定链紫红笛鲷
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

组织蛋白酶S(CTSS)属于木瓜蛋白酶家族,在二十世纪七十年代首次从牛的淋巴结与脾脏中分离出来。研究发现CTSS在生物体早期抗原呈递过程中发挥关键作用,主要通过降解MHC(主要组织相容性复合物)II结合的恒定链(Ii链),使占据MHC II复合体抗原肽结合槽的CLIP(class II associated invariant chain peptide)片段暴露,在伴侣分子的作用下外源抗原肽与MHC II分子结合,形成的复合体被呈递在CD4+细胞表面。目前对鱼类仅是在核酸水平上来研究CTSS,对鱼类CTSS在体内抗原呈递的功能研究更少。本课题通过构建紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)的cDNA文库,随机挑选5000个克隆大规模测序后将获得的EST序列在三个数据库中进行BLAST比对筛选疑似片段,并从活体中克隆得到了疑似CTSS的全长cDNA片段,与其他物种的CTSS比较相似性为60%~83%,通过原核表达得到了具有催化活性的目的蛋白,可以催化人工合成底物Z-Phe-Arg-NMec,活性可以被E-64完全抑制,并且在中性或碱性溶液中稳定,由此证明此蛋白确实为紫红笛鲷的组织蛋白酶S。在对紫红笛鲷CTSS抗原呈递功能研究中发现,巨噬细胞体外刺激24小时后其中CTSS的mRNA表达水平显著增大,体外条件下使用CTSS对重组表达得到的Ii链体外剪切,发现紫红笛鲷的CTSS可以在体外剪切自身体内的Ii链,表明鱼体内的CTSS在其抗原呈递过程中发挥着重要的作用。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
主要符号对照表  8-9
第1章前言  9-16
  1.1 背景简介  9-15
    1.1.1 组织蛋白酶S  9-12
      1.1.1.1 组织蛋白酶S 概述  9-10
      1.1.1.2 分子结构  10-11
      1.1.1.3 组织蛋白酶活性检测  11-12
    1.1.2 组织蛋白酶S 在抗原呈递中的作用  12-15
      1.1.2.1 抗原呈递过程  12-13
      1.1.2.2 恒定链在抗原呈递过程中的作用  13-14
      1.1.2.3 组织蛋白酶与恒定链的剪切  14-15
    1.1.3 组织蛋白酶S 的其他生物学功能  15
  1.2 研究的目的意义  15-16
第2章材料和方法  16-36
  2.1 材料  16-17
    2.1.1 实验动物  16
    2.1.2 实验试剂  16-17
    2.1.3 主要仪器  17
  2.2 实验方法  17-36
    2.2.1 紫红笛鲷cDNA 文库构建  17
    2.2.2 PCR 扩增目的片段  17-19
    2.2.3 PCR 产物胶回收纯化  19
    2.2.4 DNA 片段的连接  19-20
    2.2.5 感受态细胞的制备  20-21
    2.2.6 紫红笛鲷头肾总RNA 提取  21
    2.2.7 cDNA 的合成  21
    2.2.8 目的基因开放阅读框的克隆  21-22
    2.2.9 质粒的提取  22-23
    2.2.10 质粒酶切  23
    2.2.11 确定重组蛋白的诱导表达时间  23-24
    2.2.13 蛋白诱导表达  24
    2.2.14 纯化包涵体  24-25
    2.2.15 变性条件下纯化蛋白  25-26
    2.2.16 蛋白复性  26-27
    2.2.17 多克隆抗体的制备  27
    2.2.18 抗体效价的检测  27-28
    2.2.19 复性后组织蛋白酶S 自剪切  28-29
    2.2.20 Western blot 检测  29
    2.2.21 酶活性检测  29-30
    2.2.22 巨噬细胞分离  30-31
    2.2.23 枯草芽孢杆菌刺激以及RT-PCR 检测CTSS 的mRNA 变化  31-32
    2.2.24 CTSS 体外剪切Ii 链蛋白  32-33
    2.2.25 巨噬细胞分离  33-34
    2.2.26 枯草芽孢杆菌刺激以及 RT-PCR 检测 CTSS 的 mRNA 变化  34-35
    2.2.27 CTSS 体外剪切 Ii 链蛋白  35-36
第3章组织蛋白酶S 的重组表达以及鉴定  36-45
  3.1 组织蛋白酶S 序列  36-37
  3.2 BLAST 相似性分析  37-38
  3.3 CLUSTAL 分析  38-39
  3.4 进化树构建  39-40
  3.5 蛋白重组表达以及纯化  40-41
  3.6 CTSS 多克隆抗体效价检测  41-42
  3.7 蛋白复性及自激活检测  42-43
  3.8 酶活性检测  43-45
第4章组织蛋白酶S 抗原呈递功能研究  45-51
  4.1 恒定链（II 链）序列信息  45-46
  4.2 BLAST 相似性  46-47
  4.3 蛋白重组表达以及纯化  47
  4.4 多克隆抗体制备与效价检测  47-48
  4.5 刺激巨噬细胞及REAL-TIME PCR  48-49
  4.6 重组恒定链（II 链）体外剪切  49-51
第5章结论与讨论  51-54
参考文献  54-58
致谢  58-59
个人简历  59

紫红笛鲷组织蛋白酶S的鉴定与其在抗原呈递中的功能

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