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三氧化二砷对哮喘小鼠Th17/IL-17轴的影响及机制

作　者: 张莉
导　师: 向旭东
学　校: 中南大学
专　业: 内科学
关键词: 支气管哮喘 CD4~+T细胞 Th17/IL-17 三氧化二砷 凋亡 线粒体
分类号: R562.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


背景：支气管哮喘是一种与免疫功能紊乱有关的慢性气道炎症性疾病,"Th1/Th2失衡,Th2优势分化”的理论在哮喘发病机制方面一直占主导地位。Th17细胞是新近发现的又一类CD4+T细胞亚群,主要通过其分泌的IL-17起作用。最新研究显示Th17/IL-17也参与了哮喘的发生、发展,可能是哮喘难治的重要原因。三氧化二砷(ATO)是一种古老而神奇的中药,中医实践表明它具有良好的平喘作用,但其作用机制尚不清楚。三氧化二砷的平喘作用是否与抑制哮喘Th17/IL-17的表达有关?机制又是什么?目前未见报道。目的：观察三氧化二砷的平喘作用及对Th17细胞、IL-17表达的影响,并与地塞米松的作用比较,初步探讨其治疗支气管哮喘的作用是否与通过线粒体相关途径诱导哮喘CD4+T细胞凋亡有关。方法：①40只SPF级雌性BALB/c小鼠随机分为4组：正常组(PBS/PBS)、哮喘组(OVA/PBS)、ATO干预组(OVA/ATO)、DXM干预组(OVA/DXM),以OVA致敏、激发建立哮喘模型,末次激发24 h后处理小鼠。对小鼠进行行为学观察,检测气道反应性,肺组织病理切片观察炎症浸润及黏液分泌,收集BALF行细胞学分类、计数,检测BALF中IL-17的浓度。②研磨各组小鼠脾脏,制备单个核细胞悬液,免疫磁珠分离脾脏CD4+T细胞,计算每组小鼠脾源性CD4+T细胞总数,判断细胞活力,流式仪检测各组小鼠Th17细胞阳性率。③将免疫磁珠分离的哮喘组脾脏CD4+T细胞分成3组：哮喘CD4+T细胞原液组(OVA)、哮喘CD4+T细胞+ATO组(OVA/ATO).哮喘CD4+T细胞+DXM组(OVA/DXM),干预、培养20h后,流式细胞术检测上述3组CD4+T细胞的早期凋亡率,比较哮喘CD4+T细胞原液组(OVA)、哮喘CD4+T细胞+ATO组(OVA/ATO)的线粒体膜电位、胞内Ca2+浓度,ELISA检测哮喘CD4+T细胞原液组(OVA)、哮喘CD4+T细胞+ATO组(OVA/ATO)培养上清液中的IL-17含量。④对哮喘小鼠脾脏Th17细胞阳性率与中性粒细胞数、哮喘小鼠BLAF中IL-17浓度与中性粒细胞数、哮喘CD4+T细胞+ATO组CD4+T细胞早期凋亡率与其培养上清液中的IL-17含量进行相关性分析。结果：(1)哮喘组小鼠出现典型的哮喘样症状,ATO和DXM干预组小鼠症状有所减轻,而正常组小鼠表现正常；(2)与正常组相比,哮喘组气道反应性明显增高(P<0.05)；而与哮喘组相比,ATO干预组和DXM干预组气道反应性均有所降低(均P<0.01),并且两组间没有显著差异(P>0.05)；(3)与正常组相比,哮喘组肺部大量炎症细胞浸润、杯状细胞增生、气道黏液高分泌(均P<0.01),而ATO和DXM干预组气道炎症和黏液高分泌均有所缓解(均P<0.01),并且两组间没有统计学差异(P>0.05)；(4)与正常组相比,哮喘组BALF中白细胞总数、Eos、Lym、Neu均显著升高(均P<0.01),而ATO和DXM干预组白细胞总数、Eos、Lym、Neu均有所降低(均P<0.05),但在抑制Neu方面ATO较DXM强(P<0.01)；(5)与正常组相比,哮喘组BALF中IL-17的浓度显著增高(P<0.01),而ATO和DXM干预组BALF中IL-17的浓度均有所降低(均P<0.01),并且两组间没有统计学差异(P>0.05)；(6)与正常组相比,哮喘组小鼠脾脏中CD4+T细胞数量明显增多P<0.01)；而与哮喘组相比,ATO和DXM干预组脾脏CD4+T细胞数量均明显减少(均P<0.01),并且两组间没有统计学差异(P>0.05)；(7)与正常组相比,哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞中Th17细胞阳性率显著增加(P<0.01),而ATO和DXM干预组Th17细胞阳性率有所降低(均P<0.01),并且两组间没有统计学差异(P>0.05)；(8)与哮喘CD4+T细胞原液组相比,哮喘CD4+T细胞+ATO组、哮喘CD4+T细胞+DXM组CD4+T细胞的早期凋亡率均显著升高(P<0.01),并且两组间没有统计学差异(P>0.05)；(9)与哮喘CD4+T细胞原液组相比,哮喘CD4+T细胞+ATO组线粒体膜电位明显下降(P<0.05)；(10)与哮喘CD4+T细胞原液组相比,哮喘CD4+T细胞+ATO组细胞内Ca2+浓度明显增高(P<0.01)；(11)与哮喘CD4+T细胞原液组相比,哮喘CD4+T细胞+ATO组培养上清液中的IL-17含量明显下降(P<0.01)；(12)哮喘小鼠脾脏Th17细胞阳性率与BALF中中性粒细胞数呈显著正相关(r=0.998,P<0.05)；(13)哮喘小鼠BLAF中IL-17浓度与中性粒细胞数呈显著正相关(r=0.982,P<0.05)；(14)哮喘CD4+T细胞+ATO组CD4+T细胞早期凋亡率与其培养上清液中的IL-17含量呈显著负相关(r=-0.956,P<0.05)结论：(1)本实验中建立的哮喘小鼠模型是成功的,Th17/IL-17轴参与了哮喘的发病过程；(2)ATO有治疗哮喘,尤其是中性粒细胞引起的非EOS性哮喘的潜在价值；(3)ATO能起到良好的的平喘作用,这可能与其抑制哮喘Th17/IL-17轴的表达有关；(4)通过线粒体相关途径诱导哮喘CD4+T细胞凋亡,可能是ATO抑制哮喘Th17/IL-17轴表达的机制之一

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
缩略词表  11-14
前言  14-16
第一章 材料与方法  16-28
  1 实验对象  16
    1.1 实验动物  16
    1.2 饲养条件  16
  2 仪器设备与试剂  16-18
    2.1 仪器设备  16-17
    2.2 主要试剂与耗材  17-18
  3 试剂的配制  18-19
  4 实验方法  19-27
    4.1 建立哮喘小鼠模型及给药  19-20
    4.2 气道反应性(AHR)的测定  20-21
    4.3 支气管肺泡灌洗液(BALF)的收集、计数和分类计数  21-22
    4.4 肺组织病理切片、染色  22
    4.5 病理图像分析  22
    4.6 无菌取脾制备单个核细胞悬液  22-23
    4.7 小鼠脾源性CD4~+T细胞的分离  23-24
    4.8 流式检测细胞内因子——IL-17A  24
    4.9 小鼠脾源性CD4~+T细胞分组、培养  24-25
    4.10 Annexin-V/PI双染检测CD4~+T细胞早期凋亡率  25
    4.11 JC-1荧光探针检测线粒体膜电位变化  25-26
    4.12 Fluo-3 AM荧光探针检测细胞内钙离子变化  26-27
    4.13 ELISA法检测BALF和细胞培养液上清IL-17水平  27
  5 统计分析  27-28
第二章 结果  28-41
  1 各组小鼠行为学观察  28
  2 小鼠气道反应性检测  28-29
  3 各组小鼠肺组织病理结果  29-31
    3.1 肺组织病理图片  29-30
    3.2 组织学半定量分析  30-31
  4 各组小鼠BALF中的白细胞总数和分类计数  31-32
  5 各组小鼠BALF中IL-17的浓度  32-33
  6 各组小鼠脾源性CD4~+T细胞总数的比较  33-34
  7 小鼠脾源性CD4~+T细胞的活性  34
  8 各组小鼠脾源性CD4~+T细胞中Thl7细胞阳性率的比较  34-36
  9 各组小鼠脾源性CD4~+T细胞早期凋亡率的比较  36-37
  10 ATO诱导线粒体膜电位下降  37-38
  11 ATO诱导CD4+T细胞内钙离子浓度增加  38-39
  12 培养上清液中的IL-17含量  39
  13 相关性分析  39-41
第三章 讨论  41-48
  1 OVA雾化攻击能诱导致敏小鼠出现典型的哮喘表现  41-42
  2 Th17/IL-17轴参与哮喘免疫源性气道炎症  42-43
  3 ATO减轻哮喘小鼠气道炎症和气道高反应性  43-44
  4 ATO的平喘作用与抑制哮喘Th17/IL-17轴引发的炎症反应有关  44-45
  5 ATO可能通过促进CD4~+T细胞凋亡而抑制哮喘Th17/IL-17轴  45-46
  6 线粒体参与ATO诱导CD4~+T细胞凋亡  46-48
第四章 结论  48-49
参考文献  49-54
综述  54-62
  参考文献  59-62
致谢  62-63
攻读学位期间研究成果  63

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 呼吸系及胸部疾病 > 气管和支气管疾病 > 支气管疾病 > 支气管哮喘
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