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β-甘露聚糖酶基因测序、克隆表达及其工程菌的代谢通量研究

作　者: 武伟娜
导　师: 齐崴
学　校: 天津大学
专　业: 化学工程
关键词: β-甘露聚糖酶 16S rDNA 序列大肠杆菌基因克隆表达代谢通量分析热稳定性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

β-甘露聚糖酶是一种重要的半纤维素酶,可应用于食品、医药、饲料、采油等许多领域。本文以β-甘露聚糖酶的分子生物学研究为核心,利用基因工程和代谢工程的方法开展工作,主要结论如下:菌株鉴定:综合运用形态观察、生理生化实验及16S rDNA 序列分析的方法鉴定了实验室保藏的产β-甘露聚糖酶菌株的属种,结果表明:该菌株为枯草芽孢杆菌,并命名为Bacillus subtilis TJ-200603。序列信息:利用简并PCR的方法确定了Bacillus subtilis TJ-200603β-甘露聚糖酶的保守序列,与Bacillus subtilis G1(DQ309335)具有高达98%的同源性,再经同源PCR最终确定了β-甘露聚糖酶的完整序列,在线工具预测表明:ORF包含1104bp,编码367个氨基酸,前31个氨基酸为信号肽,后面336个氨基酸为β-甘露聚糖酶成熟肽,蛋白分子量为38kDa,等电点为5.6。氨基酸序列分析表明:Bacillus subtilis TJ-200603甘露聚糖酶属于糖苷水解酶家族26。目前,β-甘露聚糖酶序列已在向GenBank库提交中。大肠杆菌中的克隆、表达:成功构建了重组克隆质粒pMD–man,实现了在E.coli DH5α中的克隆;成功构建了重组表达质粒pET-22b-man,实现了在E.coli BL21 (DE3)中的诱导表达。SDS-PAGE表明:表达的重组蛋白分子量约为38.005kDa,与预测值基本一致。蛋白主要集中在周质空间和胞内,含量分别为36.03μg/mL和97.02μg/mL,酶活分别为4.8U/mL和6.7U/mL。代谢通量分析:建立了大肠杆菌基因工程菌的代谢网络,利用代谢通量分析的方法,对大肠杆菌工程菌产甘露聚糖酶的代谢途径进行了分析,并对其中5个重要节点做了详细讨论。热稳定性研究:基于已获知的β-甘露聚糖酶一级序列及同源模建得到的酶蛋白高级结构,并利用羟基可与酶活性位点形成氢键而稳定高级结构的结论,筛选酶蛋白的多羟基保护剂。山梨醇(2g/L)、蔗糖(2g/L)、壳聚糖(2g/L)使β-甘露聚糖酶的相对酶活分别达到222.8%、201.3%、198.7%;山梨醇(2g/L)、壳聚糖(1g/L)、蔗糖(3g/L)的复合保护剂使β-甘露聚糖酶的相对酶活达到最高,为258.1%;β-甘露聚糖酶的最适反应温度从原来的50℃提高到60℃,65℃下失活速率常数kinac减小、半衰期t1/2延长,均表明了保护剂对β-甘露聚糖酶的稳定作用。

全文目录

中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
前言  9-10
第一章文献综述  10-27
  1.1 β-甘露聚糖酶产生菌  10-12
    1.1.1 β-甘露聚糖酶的来源  10-11
    1.1.2 β-甘露聚糖酶产生菌的筛选  11
    1.1.3 β-甘露聚糖酶产生菌的鉴定  11-12
  1.2 β-甘露聚糖酶的分子生物学研究  12-21
    1.2.1 β-甘露聚糖酶的克隆与序列特点  12-16
    1.2.2 β-甘露聚糖酶的表达  16-18
    1.2.3 表达载体  18-19
    1.2.4 大肠杆菌表达系统  19-21
  1.3 代谢网络及代谢通量分析  21-22
  1.4 β-甘露聚糖酶的结构与稳定性  22-23
  1.5 β-甘露聚糖酶的应用  23-25
    1.5.1 在饲料添加剂中的应用  23
    1.5.2 在纸浆工业中的应用  23-24
    1.5.3 在食品中的应用  24
    1.5.4 在石油破胶剂中的应用  24
    1.5.5 在其他方面的应用  24-25
  1.6 本文主要研究内容  25-27
第二章 β-甘露聚糖酶生产菌株的鉴定  27-43
  2.1 材料  27-29
    2.1.1 菌种与质粒  27
    2.1.2 试剂盒、工具酶和生化试剂  27
    2.1.3 培养基  27-28
    2.1.4 主要溶液  28-29
    2.1.5 实验室仪器  29
  2.2 实验方法  29-35
    2.2.1 刚果红染色法对菌株的筛选鉴定  29-30
    2.2.2 β-甘露聚糖酶产生菌株的常规鉴定  30
    2.2.3 16S rDNA 系统发育分析  30-35
  2.3 结果与讨论  35-42
    2.3.1 刚果红染色快速鉴定  35
    2.3.2 形态与生理生化鉴定  35-37
    2.3.3 16S rDNA 系统发育分析  37-42
  2.4 小结  42-43
第三章 Bacillus subtilis TJ-200603β-甘露聚糖酶的测序、克隆与表达  43-70
  3.1 材料  43-45
    3.1.1 菌种与质粒  43
    3.1.2 试剂盒、工具酶和生化试剂  43
    3.1.3 主要溶液  43-44
    3.1.4 实验室仪器  44-45
  3.2 实验方法  45-56
    3.2.1 β-甘露聚糖酶基因部分序列的分析  45-46
    3.2.2 β-甘露聚糖酶基因全长序列的分析  46-47
    3.2.3 β-甘露聚糖酶成熟肽的基因克隆  47-48
    3.2.4 原核表达载体 pET-22b-man 的构建与转化  48-52
    3.2.5 重组蛋白的诱导表达  52-56
  3.3 结果与讨论  56-69
    3.3.1 β-甘露聚糖酶基因部分序列的分析  56-59
    3.3.2 β-甘露聚糖酶基因全长序列的分析  59-64
    3.3.3 β-甘露聚糖酶成熟肽的基因克隆  64-66
    3.3.4 原核表达载体 pET-22b-man 的构建与转化  66-67
    3.3.5 重组蛋白的诱导表达  67-69
  3.4 小结  69-70
第四章产β-甘露聚糖酶大肠杆菌工程菌的代谢通量分析  70-79
  4.1 代谢通量分析原理  70-71
  4.2 E.coli 的生化反应网络  71-73
  4.3 E.coli 代谢模型的建立  73
  4.4 E.coli 代谢模型的优化计算  73
  4.5 结果与讨论  73-78
    4.5.1 以β-甘露聚糖酶的生物合成为优化目标的代谢流分析  73-74
    4.5.2 以菌体的生长为优化目标的代谢流分析  74-75
    4.5.3 代谢网络中重要节点的比较分析  75-78
  4.6 小结  78-79
第五章 β-甘露聚糖酶热稳定性的研究  79-88
  5.1 材料  79-80
    5.1.1 试剂  79-80
    5.1.2 实验室仪器  80
  5.2 实验方法  80-82
    5.2.1 酶活力的测定方法  80
    5.2.2 酶液与保护剂贮液的配制  80
    5.2.3 酶热稳定性的测定  80
    5.2.4 复合保护剂配比的正交设计  80-81
    5.2.5 保护剂存在时β-甘露聚糖酶最适反应温度的测定  81
    5.2.6 β-甘露聚糖酶热失活曲线的测定与失活参数的计算  81-82
  5.3 结果与讨论  82-87
    5.3.1 单一保护剂对β-甘露聚糖酶稳定性的影响  82-83
    5.3.2 不同配比的复合保护剂对β-甘露聚糖酶稳定性的影响  83-85
    5.3.3 保护剂存在时β-甘露聚糖酶最适反应温度  85
    5.3.4 65℃下β-甘露聚糖酶失活动力学和热力学及保护机理分析  85-87
  5.4 小结  87-88
第六章结论与展望  88-91
  6.1 结论  88-89
  6.2 展望  89-91
参考文献  91-98
发表论文和参加科研情况  98-99
附录  99-104
致谢  104

β-甘露聚糖酶基因测序、克隆表达及其工程菌的代谢通量研究

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