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赤丸芜菁BrCHS表达特性及启动子特性分析

作　者: 张荔
导　师: 李玉花
学　校: 东北林业大学
专　业: 发育生物学
关键词: CHS 启动子 UVA 功能分析 转基因烟草
分类号: S631.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


查尔酮合成酶(CHS)是高等植物体内花色素合成途径中的第一个关键酶,它催化的反应是类黄酮合成途径中的重要步骤,CHS基因表达量的增加或减少都可能导致花色产生变异。目前的研究发现,UV-A可以特异诱导花青素合成依光型津田芜菁体内CHS基因的表达。为了研究在非依光型赤丸芜菁中CHS的光诱导表达特性和启动子的相关活性,本论文以非依光型花青素合成的赤丸芜菁为试验材料,克隆了BrCHS基因及启动子片段,对BrCHS拷贝数和表达特性进行了分析,并对获得的基因进行生物信息学分析,利用实时定量PCR技术分析非依光型花青素合成的赤丸芜菁中CHS基因在不同组织中和在UV-A光诱导下的表达模式,并转化烟草叶片对启动子进行分析,检测报告基因的表达活性。研究的主要结果如下：1赤丸芜菁CHS的克隆及拷贝数从赤丸芜菁中克隆了BrCHS的基因片段,将获得的1263bp BrCHS基因序列片段与GenBank中同源序列进行BLAST比对,结果表明该片段与GenBank中Brassica napus chalcone synthase (Chs) gene, exonl,2 and partia(登录号为GQ983005.1)的部分序列具有98%的同源性,其中含有两个外显子和一个内含子。Southern杂交结果表明,BrCHS基因在赤丸芜菁基因组中至少有四个拷贝,属于多基因家族。2.赤丸芜菁CHS的表达特性在检测的不同组织中,非依光型赤丸芜菁CHS在下根皮的表达最多,上根皮次之,叶子中最少。赤丸芜菁CHS在UV-A诱导下幼苗的表达特性说明,UV-A能够诱导BrCHS的表达,且在幼苗下胚轴的中间部位受诱导表达最明显,推测在该部位存在光特异诱导花青素合成的调控途径,说明存在着光诱导的组织特异性表达。3赤丸芜菁CHS基因5,非翻译区具有启动活性克隆了赤丸芜菁BrCHS的5’非翻译区,结果表明该片段与GenBank中Brassica rapa subsp. pekinensis clone KBrB008I08 (登录号为AC189212)的全长序列具有99%的同源性。生物信息学分析结果显示,该序列除了具有一般真核生物启动子结构所普遍具有的保守序列如CAATbox和TATAbox等保守序列外,找到了很多与光诱导相关的保守序列,如：ACE、ATCT-motif、BoxⅡ、G-Box、GATA-motif、GT1-motif、TCT-motif、Spl和chs-Unit 1 ml。通过农杆菌介导的遗传转化技术将BrCHS启动子重组体转化烟草,在稳定遗传的转基因烟草中定性分析启动子的活性,通过GUS组织化学染色法对CHS基因的表达情况进行了检测,结果表明克隆的BrCHS基因5’非翻译区序列具有启动子活性。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
1 绪论  9-17
  1.1 课题背景  9
  1.2 花青素合成相关基因的研究及应用  9-10
    1.2.1 花青素的化学结构和种类  9-10
    1.2.2 花色素的生物合成途径及相关基因  10
  1.3 植物启动子的研究进展  10-15
    1.3.1 引言  10-11
    1.3.2 植物启动子的多样性  11-12
    1.3.3 植物启动子的基本结构  12-13
    1.3.4 启动子的克隆方法  13-14
    1.3.5 启动子的研究方法  14-15
  1.4 植物CHS基因及其启动子的研究进展  15
  1.5 实时荧光定量PCR技术  15-16
  1.6 本研究的目的与意义  16-17
2 赤丸芜菁CHS基因的克隆及表达分析  17-34
  2.1 引言  17
  2.2 试验材料与试剂  17-18
    2.2.1 试验材料  17
    2.2.2 试验试剂  17-18
  2.3 试验方法  18-26
    2.3.1 赤丸芜菁总DNA的提取(CTAB法)  18
    2.3.2 BrCHS基因片段的扩增  18-21
    2.3.3 BrCHS基因保守序列引物设计  21
    2.3.4 BrCHS基因的Southern杂交  21-24
    2.3.5 BrCHS基因的表达特性分析  24-26
  2.4 结果与分析  26-32
    2.4.1 赤丸芜菁总DNA质量检测  26-27
    2.4.2 PCR扩增BrCHS基因片段  27-28
    2.4.3 赤丸芜菁BrCHS基因片段序列分析  28-29
    2.4.4 赤丸芜菁BrCHS基因的Southern杂交分析  29-30
    2.4.5 赤丸芜菁中CHS基因的表达特性分析  30-32
  2.5 本章小结  32-34
    2.5.1 讨论  32-33
    2.5.2 小结  33-34
3 BRCHS基因启动子的克隆及活性分析  34-53
  3.1 引言  34
  3.2 材料及试剂  34-35
    3.2.1 材料  34
    3.2.2 试剂  34-35
  3.3 试验方法  35-41
    3.3.1 引物设计  35
    3.3.2 PCR反应扩增含CHS启动子的序列  35-37
    3.3.3 BrCHS基因启动子的表达载体构建  37-38
    3.3.4 BrCHS启动子转化农杆菌  38-39
    3.3.5 农杆菌介导的BrCHS启动子区的烟草遗传转化  39-40
    3.3.6 转基因烟草的鉴定  40-41
    3.3.7 转基因烟草的Gus组织化学染色分析  41
  3.4 结果与分析  41-52
    3.4.1 赤丸芜菁总DNA质量检测  41-42
    3.4.2 PCR扩增BrCHS启动子片段  42
    3.4.3 赤丸芜菁BrCHS启动子片段序列分析  42-44
    3.4.4 赤丸芜菁CHS启动子区的序列分析  44-48
    3.4.5 BrCHS基因启动子表达载体构建  48-49
    3.4.6 BrCHS启动子转化农杆菌EHA105  49
    3.4.7 转基因烟草植株的获得  49-50
    3.4.8 烟草转基因株系的PCR检测  50
    3.4.9 转基因烟草的Gus组织化学染色检测  50-51
    3.4.10 讨论  51-52
  3.5 小结  52-53
结论  53-54
参考文献  54-58
攻读期间发表的学术论文  58-59
致谢  59-60

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 蔬菜园艺 > 根菜类（直根类） > 芜菁
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