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荧光假单胞菌7-14生物膜突变株的筛选及tatC基因的克隆与功能初析

作　者: 康越景
导　师: 刘凤权
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 转座诱变 生物膜 基因克隆 tatC基因 同源重组 功能分析
分类号: S432.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


利用mariner转座子对荧光假单胞菌7-14(Pseudomonas fluorescens 7-14, Pf7-14)进行转座诱变,成功构建了Pf7-14的突变体文库。利用96孔板筛选法,从8500多株突变体中筛选得到一株生物膜增强突变株4B5和一株生物膜减弱突变株25C11。通过任意PCR (arbitrary polymerase amplification reacrion, arbitrary PCR)和亚克隆技术鉴定出,4B5的转座子插入的位点与P. fluorescens Pf0-1编码chemotaxis sensory transducer的基因,与P. fluorescens Pf-5编码methyl-accepting chemotaxis transducer的基因具有很高的同源性,25C11的转座子插入的位点与P. fluorescens Pf-5和Pf0-1的编码lipoyltransferase的基因lipB高度同源。根据Pf0-1和Pf-5相关基因的序列设计简并引物,从Pf7-14中扩增出了对应的基因。油菜离体叶片的菌体分布试验表明,和Pf7-14野生型相比,4B5在油菜叶片上粘附的细胞数量较多,25C11粘附的细胞数量较少。根据荧光假单胞菌Pf-5和SBW25的tatC基因序列设计简并引物,采用PCR方法从Pf7-14中克隆了tatC基因,命名为tatCPf7-14。通过序列分析,我们比较了tatCPf7-14与同种、同属和其它相关细菌中tatC基因的核酸序列的同源性,以及TatCPf7-14与这些细菌中TatC蛋白的氨基酸序列的同源性。通过同源重组单交换的方法,构建了Pf7-14 tatC基因的插入突变株。研究发现,(1)tatC突变株的蛋白酶、嗜铁素的产量较野生型有所降低；(2)tatC突变体的游动能力和生物膜形成能力均弱于野生型。互补菌株均恢复了上述性状。tatC基因的突变未改变Pf7-14在LB培养基中的生长速率。平板拮抗试验显示,突变体对主要病原真菌仍具有很好的拮抗能力。

全文目录


摘要  7-8ABSTRACT  8-9上篇 文献综述  9-31  第一章 荧光假单胞菌植物病害生物防治的研究进展  10-20    1 植物病害生物防治与拮抗微生物  10-12      1.1 植物病害生物防治的概念  10      1.2 用于植物病害生物防治的主要拮抗微生物种类  10-12    2 荧光假单胞菌的生防机制  12-20      2.1 荧光假单胞菌的分类属性  12      2.2 竞争作用  12-13      2.3 抗生作用  13-18      2.4 诱导抗性  18-20  第二章 生物膜及双精氨酸蛋白运输系统的研究进展  20-31    1 生物膜的研究进展  20-25      1.1 什么是生物膜  20      1.2 生物膜的组成及形成过程  20-21      1.3 生物膜与定殖  21-22      1.4 生物膜形成的相关因素  22-25    2 双精氨酸蛋白质运输系统的研究进展  25-31      2.1 Tat转运系统的组成和遗传学特性  25-27      2.2 Tat系统信号肽  27-28      2.3 Tat系统的底物蛋白质  28-29      2.4 Tat系统的功能  29-31下篇 研究内容  31-72  第一章 荧光假单胞菌7-14突变体文库的建立及生物膜形成突变株的筛选  32-54    1 试验材料  33-35      1.1 供试菌株和质粒  33      1.2 培养基  33-34      1.3 菌株的培养条件  34      1.4 引物  34-35      1.5 引物合成与序列测定  35      1.6 酶、抗生素及其它化学试剂  35    2 试验方法  35-46      2.1 细菌基因组DNA的提取  35-36      2.2 质粒DNA的提取  36-37      2.3 DNA凝胶电泳及DNA片段浓度、大小测算  37      2.4 PCR扩增、DNA酶切、连接、回收纯化和TA克隆  37-38      2.5 质粒DNA的转化  38-40      2.6 地高辛标记探针Southern杂交试验  40-42      2.7 Pf7-14转座子插入文库的构建及验证  42-43      2.8 Pf7-14生物膜形成突变株的筛选和测定  43-44      2.9 Pf7-14生物膜形成突变株中转座子拷贝数的验证  44      2.10 生物膜形成突变株4B5和25C11转座子插入位点的鉴定  44-45      2.11 序列分析  45      2.12 突变体4B5和25C11转座子插入位点基因的克隆  45      2.13 菌体在油菜叶片上的分布情况  45-46    3 结果  46-52      3.1 Pf7-14转座子插入文库的构建及验证  46-47      3.2 Pf7-14生物膜突变株25C11、4B5的获得  47      3.3 mariner转座子的拷贝数鉴定  47-48      3.4 转座子在菌株25C11和4B5中的插入位点鉴定  48-50      3.5 Pf7-14 mmct基因、lipB基因的克隆  50-52      3.6 Pf7-14、25C11和4B5在油菜叶片上的分布情况  52    4 讨论  52-54  第二章 Pf7-14 tatC基因的克隆、突变及功能初析  54-72    1 试验材料  55-57      1.1 试验菌株、质粒  55      1.2 培养基配制  55-56      1.3 菌株的培养条件  56      1.4 引物  56-57      1.5 引物合成和序列测定  57      1.6 酶、抗生素及化学试剂  57    2 试验方法  57-61      2.1 细菌基因组DNA、质粒的提取和质粒DNA的转化  57      2.2 DNA凝胶电泳及DNA片段浓度、大小测算  57      2.3 PCR扩增、DNA酶切、连接、回收纯化和TA克隆  57      2.4 序列分析  57      2.5 tatC基因(795bp)的克隆  57-58      2.6 Pf7-14 tatC突变株的构建及验证  58      2.7 互补菌株CPTATC的构建及验证  58-59      2.8 生长速率测定  59      2.9 蛋白酶的检测  59-60      2.10 嗜铁素产量的检测  60      2.11 生物膜测定  60      2.12 游动性检测  60      2.13 细胞形态观察  60      2.14 对病原真菌的平板拮抗试验  60-61    3 结果  61-69      3.1 Pf7-14 tatC基因的克隆及序列分析  61-62      3.2 Pf7-14 tatC基因突变株的构建  62-64      3.3 互补菌株CPTATC的构建及验证  64-65      3.4 tatC基因的突变不影响Pf7-14正常生长  65-66      3.5 tatC基因的突变影响了胞外蛋白酶和嗜铁素的产生  66      3.6 tatC基因的突变降低了生物膜的形成  66-67      3.7 tatC基因的突变降低了菌体的游动性  67-68      3.8 tatC基因的突变没有改变细胞形态  68-69      3.9 tatC基因突变不影响Pf-7-14对主要病原真菌的拮抗能力  69    4 讨论  69-72附录  72-82参考文献  82-92致谢  92

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵（传）染性病害
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